生物化学与分子生物学技术

概论生物技术的定义利用生物(动物、植物或微生物)或其产物来生产对人类生命科学有用的物质或生物。●传统生物技术：酿造配育新种以生物化学或分子生物学的操作方法，来改变生物或其分子(遗传)形质，以达预期目的。●現代生物技术：EnzDNACellAbHybridoma融合瘤定点突变生物信息学蛋白组学Abzyme催化性抗体反义基因DNA/RNA基因转移ModernBiotechnology酶学工艺诊断试剂抗体治疗基因治疗细胞融合组织培养干細胞动物克隆基因工程生物芯片人类基因组计划PCR聚合酶链放应电泳层析离心分光光度基因操作其它分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）基本模式“纵向”体系“横向”体系1理论部分基因工程原理生化技术原理新技术讲座2实验部分分子生物学实验生化技术实验3录像部分实验原理实验技术基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段EcoRIBoyer和Cohen的实验Boyer和Cohen的实验pSC101pR6-5大肠杆菌pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培养平皿卡那霉素基因四环素\卡那霉素基因大肠杆菌四环素平板抗四环素抗卡那霉素抗四环素\抗卡那霉素人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg---50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线目的基因及载体的分离需要克隆的DNA片段：化学合成法cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应1目的基因的获取1）化学合成法：较短的核酸片段（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针2）基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装cDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA基因文库的筛选：DNA探针：核酸杂交抗体：蛋白免疫杂交蛋白活性鉴定裂解变性显影引物引物*引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。3’5’5’5’3）PCR技术基因组PCR原理图3’3’3’变性、退火延伸变性、退火、延伸3’2载体DNA的选择功能：为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中扩增和表达能力。目的基因整合在宿主细胞染色体DNA中独立于宿主细胞染色体DNA外（独立的复制子功能）基因载体理想载体的基本条件：可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体……种类：存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pBR322质粒质粒宿主细胞ori抗Amp宿主细菌含Amp培养基多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体选择标记ori多克隆位点转录终止区RBSPO表达型质粒载体图噬菌体载体50kb+LARALARAEcoRⅠEcoRⅠlacZcIAmNeoPBamHⅠHindⅢoriBamHⅠHindⅢ限制性内切酶酶切酶切限制性内切核酸酶在特异位点上切割DNA分子分三类，常用为Ⅱ类酶识别序列呈回文对称命名：酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）酶切条件：酶切缓冲液低盐组：0～50mmol/LNaCl中盐组：50～100mmol/LNaCl高盐组：100～150mmol/LNaCl磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；连接方式：相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCCCGGCCGGCCGGCCGGCCCGGGGCCHapⅡT4-DNA连接酶平端连接AGCTTCGAAluⅠDNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGA同聚物加尾连接5’5’5’5’AAAAAATTTTTTTdT酶连接酶人工接头连接BamHIBamHIBamHI重组体的转化受体细胞重组体的转化JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态1原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染2）转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌基因重组转染体外包装噬菌体噬菌体体外包装3）转化率：转化细胞/细胞总数影响因素：载体：载体性质、空间结构、分子大小等受体细胞转化过程2真核细胞的转染1）受体细胞系统永生细胞系细胞特异性的选择标记对抗某种药物磷酸钙介导的转染重组体+磷酸钙微粒内吞作用重组体进入细胞2）转化方法大颗粒脂质体法重组体脂质体受体细胞重组体克隆的筛选与鉴定转化后的克隆群体：1遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板2）ß-半乳糖苷酶法2电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段3菌落杂交筛选法4免疫化学检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+免疫沉淀检测法菌落沉淀素5DNA序列检测ACTGAAGGCT真核细胞的筛选标记新霉素类药物G418筛选AmNeoPoriG418灭活（-）蛋白质合成氨基喋呤筛选法氨基喋呤核酸从头合成（-）核酸补救合成（TK酶）TK-TK+外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（E.coli）受体细胞1目的基因在E.coli中的高效表达三个因素：强化蛋白质的生物合成抑制蛋白质的降解恢复蛋白质的空间构象表达载体：转录的启动子和终止子核糖体结合位点基因拷贝数宿主细胞的翻译效率表达蛋白在细胞中的稳定性强化蛋白质的生物合成启动子终止子SDmRNA多肽链启动子：启动子最佳作用距离-转录起始点启动子的选择和改造强启动子可调控启动子P终止子：强终止子、二聚体终止子终止子启动子转录过度影响目的基因的转录和翻译效率干扰基因载体的复制等生物学功能增加受体细胞的无效能量消耗SD序列：影响翻译效率SD序列与16SrRNA的互补性SD的后续序列的碱基组成SD与起始密码之间的距离mRNASD密码子：遗传密码的偏倚性原核生物和真核生物密码子使用的差异性基因载体的拷贝数：2目的基因表达产物的检测1）蛋白质的PAGE对照样品Marker2）表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达3目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白基因载体目的基因质粒噬菌体病毒PCRcDNA人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶重组体转化转染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达