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生物化学与分子生物学进展中山大学中山医学院杨霞 yangxia@mail.sysu.edu.cn目目录录PCRPCR技术的创建技术的创建PCRPCR的原理的原理PCRPCR的的类型和应用类型和应用多聚酶链式反应多聚酶链式反应((PCRPCR::PolymeraseChainReaction)PolymeraseChainReaction)Polymerase:Polymerase:DNADNA聚合酶聚合酶基因组基因组DNA DNA 引物引物 DNA DNA聚合酶聚合酶DNADNA片段体外扩增片段体外扩增PCRPCR技术的创建技术的创建一、最初的理论描述一、最初的理论描述——KhoranaKhoranannKhoranaKhorana(1971)(1971)等最早提出核酸体外扩增的设想:等最早提出核酸体外扩增的设想:““经经DNADNA变性,与合适的引物杂交,用变性,与合适的引物杂交,用DNADNA聚合酶延伸引物,聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成并不断重复该过程便可合成tRNAtRNA基因。基因。””nn但由于当时基因序列分析方法尚未成熟,热稳定但由于当时基因序列分析方法尚未成熟,热稳定DNADNA聚聚合酶尚未报道以及引物合成的困难,这种想法似乎没有合酶尚未报道以及引物合成的困难,这种想法似乎没有实际意义。加上实际意义。加上7070年代初分子克隆技术的出现提供了一年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径,所以,种克隆和扩增基因的途径,所以,KhoranaKhorana的设想被人的设想被人们遗忘了们遗忘了…………二、二、PCRPCR技术的发明技术的发明——KaryKaryMullisMullisnn19851985年,年,KaryKaryMullisMullis在在CetusCetus公司工作期间,发明了公司工作期间,发明了PCRPCRnnMullisMullis要合成要合成DNADNA引物来进行测序工作,却常为没有足引物来进行测序工作,却常为没有足够多的模板够多的模板DNADNA而烦恼而烦恼nn19831983年年44月的一个星期五晚上,他开车去乡下别墅的路月的一个星期五晚上,他开车去乡下别墅的路上上…………PCRPCR技术的创建技术的创建nn PCR PCR从构想成为现实从构想成为现实 1983 1983年年12 12月,月, Mullis Mullis用同位素标记法看到了用同位素标记法看到了10 10个循环后的个循环后的49 49 bp bp 长度的第一个长度的第一个PCR PCR片断;片断; 1985 1985年年10 10月月25 25日申请了日申请了PCR PCR的专利,的专利,1987 1987年年7 7月月28 28日批准(专利日批准(专利号号4,683,202 4,683,202 ),),Mullis Mullis是第一发明人;是第一发明人; 1985 1985年年12 12月月20 20日在日在Science Science杂志上发表了第一篇杂志上发表了第一篇PCR PCR的学术论文的学术论文,,Mullis Mullis是共同作者;是共同作者; 1986 1986年年5 5月,月,Mullis Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习学习PCR PCR的方法。的方法。引物引物 Mullis Mullis 的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNA DNA片段片段 1983年9494℃变性变性5050--6565℃℃退火退火XX℃延伸延伸9494℃5555℃℃3737℃℃ ?三、三、PCR PCR技术的改进和发展技术的改进和发展nn 1988 1988年年Saiki Saiki等将耐热等将耐热DNA DNA聚合酶(聚合酶(Taq Taq)引入了)引入了PCR PCR技术,大大技术,大大提高了提高了PCR PCR的效率。的效率。Taq Taq DNA DNA聚合酶(聚合酶(thermus thermus aquaticus aquaticus) ) 酶酶活性活性(%) (%) 温度温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 207272℃℃9494℃5555℃℃ PCR PCR循环循环三、三、PCR PCR技术的改进和发展技术的改进和发展nn 1988 1988年第一台年第一台PCR PCR仪问世,仪问世,PCR PCR逐步实现自动化逐步实现自动化nn 1989 1989年美国年美国《《Science Science》》杂志列杂志列PCR PCR为十余项重大科学发明之首,为十余项重大科学发明之首,比喻比喻1989 1989年为年为PCR PCR爆炸年。爆炸年。nn 1993 1993年,年,Mullis Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。因此项技术荣获诺贝尔化学奖。Kary Kary B. Mullis B. Mullis((1944 1944-)-) PCR仪的变迁仪的变迁nn三个水浴锅,用手移动三个水浴锅,用手移动((MullisMullis等人当时用的)等人当时用的)nn电加热块电加热块++自来水冷却自来水冷却((PEPE,,19881988))nn电加热块电加热块++内置循环液冷却内置循环液冷却((PEPE,,19891989))nn三个加热块三个加热块++机械手机械手((StrategeneStrategene,,19941994))nn半导体制冷和加热(半导体制冷和加热(MJ,PE,MJ,PE,BioMetraBioMetra,,EppendorfEppendorf))nn空气加热空气加热(Roche)(Roche)nn梯度梯度PCRPCR仪仪,,实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR仪仪nnLabLab--onon--chipchip式的式的PCRPCR仪仪((芯片芯片PCR)PCR)全新4通道实时荧光定量PCR仪普通PCR仪、梯度PCR仪PCRPCR技术的原理技术的原理无细胞分子克隆法:以拟扩增的无细胞分子克隆法:以拟扩增的DNA DNA分子为模板,以一对分分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA DNA聚合酶的作用下,按聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA DNA合成。通过合成。通过不断重复这一过程,可以使目的不断重复这一过程,可以使目的DNA DNA片段得到扩增。另一方面,新片段得到扩增。另一方面,新合成的合成的DNA DNA片段也可以作为模板,因而片段也可以作为模板,因而PCR PCR技术可使技术可使DNA DNA的合成的合成量呈指数型增长。量呈指数型增长。1 1 st st cycle cycle 2 2 nd nd cycle cycle 3 3 rd rd cycle cycle 过过程程变变性性退退火火延延伸伸经典循环参数(经典循环参数(500bp 500bp以内)以内) 94 94℃℃ 30s 30s 55 55 ℃℃ 45s 45s 72 72 ℃℃ 1min 1min 94 94℃℃ 5min 5min ×30次 72 72℃℃ 7min 7min 4 4℃℃ forever foreverPCR PCR技术的特点技术的特点nn灵敏度高灵敏度高1.1.3030轮循环轮循环,,扩增量达扩增量达223030个拷贝(个拷贝(101099拷贝)拷贝)2.2.将模板从皮克将模板从皮克(pg=10(pg=10--1212))量级扩增到微克量级扩增到微克((ugug=10=10--66))水平水平3.3.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞4.4.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达33个个PFUPFU5.5.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为33个细菌个细菌nn特异性强特异性强引物序列与模板结合的特异性引物序列与模板结合的特异性nn快速简便快速简便一次性加好反应液,一次性加好反应液,22~~44小时即可完成扩增小时即可完成扩增11)不对称)不对称PCRPCR2)2)反向反向PCRPCR33)多重)多重PCRPCR44)锚定)锚定PCRPCR55)逆转录)逆转录PCRPCR66)原位)原位PCRPCR7)7)荧光定量荧光定量PCRPCR PCR PCR的类型的类型目的:扩增产生特异长度的单链目的:扩增产生特异长度的单链DNADNA。。方法:采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限方法:采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物制性引物,,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.01∶∶0.50.5μμM,M,关键是限制关键是限制性引物的绝对量。性引物的绝对量。用途:制备核酸序列测定的模板用途:制备核酸序列测定的模板制备杂交探针制备杂交探针基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究不对称不对称PCR PCR高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物反向反向PCR(reversePCR)PCR(reversePCR)用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段对某个已片段对某个已知知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析,,如探索邻接已知如探索邻接已知DNADNA片段的片段的序列;用于仅知部分序列的全长序列;用于仅知部分序列的全长cDNAcDNA的克隆的克隆,,扩增基因文库的扩增基因文库的插入插入DNADNA;;建立基因组步移文库。建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶多重多重PCRPCR(复合(复合PCRPCR))用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电泳泳引物引物 1 2 3 4 1 2 3 4DMD DMD:人类肌营养不良基因:人类肌营养不良基因 A:无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8~19 缺失 B:病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C:正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失LP LP PCR PCR((Labelled Labelled primers) primers) 利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记,,用以直观地检用以直观地检测目的基因。测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分病毒病毒11病毒病毒22病毒病毒33病毒病毒44标记引物标记引物PCRPCR观察观察 PCR PCR产物产物锚定锚定PCR PCR((anchored PCR, A anchored PCR, A PCR PCR))PCR的局限:需了解靶基因片段两侧的序列对于未知序列怎么办?cDNA cDNA 末端核酸转移酶末端核酸转移酶 3 3’ ’GG GG… …GG GG 5 5 ’ ’ CC CC… …CC CC 锚定引物锚定引物 3 3’ ’GG GG… …GG GG 5 5’ ’ CC CC… …CC CC 3 3’ ’GG GG… …GG GG CC CC… …CC CC 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾(polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物(带有限制性内切位点polydC)一起作 PCR扩增PCRPCR固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引化引物物 PCR PCR 扩增扩增探探针针亲和固亲和固相相介质介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作
本文标题:生物化学与分子生物学进展
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