生物化学实验单元

生物化學實驗單元醣類鑑定1.Molish反應(醣類)2.Seliwanoff反應(酫酮醣)3.Barfoed反應(單雙多醣)4.Schiff(AnilineAcetate)反應5.TLC分離生物工程系胺基酸鑑定1.Ninhydrin反應2.LeadAcetate(醋酸鉛)反應3.Ehrlich重氮反應4.Millon反應5.TLC分離蛋白質定量與電泳分析以Lowry與Bradford法進行蛋白質定量實驗。另外，利用NativePAGE與SDSPAGE進行蛋白質電泳分離與分析，並鑑定個別蛋白質之分子量。酵素活性檢測澱粉酶(amylase)可將澱粉水解產生還原糖，而還原糖量的多寡，可利用DNS試劑測定。由於還原糖可將DNS還原成3-amino-5-nitrosalicylicacid，且後者會吸收540nm波長的光，吸光值與濃度成正比，故可藉由偵測540nm的吸光值變化，間接檢測澱粉酶催化產生還原糖的速率，亦即酵素活性。總脂質/總膽固醇測定脂質之測定法有很多種，磷酸香草素反應法，是最簡便、快速且正確地作比色測定，其原理為檢樣中之脂質於濃硫酸中加熱，經磷酸香草素之作用，產生粉紅色的發色染料。膽固醇的測定，以冰醋酸及醋酸酐為溶媒及脫水劑，濃硫酸為脫水劑及氧化劑，金屬離子(Fe2+，Al3+，Co2+)為催化劑，或加熱至80~95C來催化反應。質體DNA萃取/PCR/核酸電泳分析本實驗以Geneaid質體抽取套組(鹼性裂解法)，從E.coli抽取含有β-glucosidaseII基因之質體pBARGEM7-2，再使用PCR方法放大目標基因片段，並以瓊膠(agarosegel)電泳來作確認，其目的在使學生熟悉重組基因操作之基本技術。胺基酸鑑定生物工程系生化實驗本實驗在利用簡單的化學反應區分胺基酸之結構特性，首先採用Ninhydrin反應將胺基酸與其他生物大分子區別。而LeadAcetate(醋酸鉛)反應、Ehrlich重氮反應、Millon反應則可針對三種特定胺基酸結構特性(Cysteine、Tryptophan與Tyrosine)於呈色型態之化學性質加以鑑定。最後再以薄層層析法有機親和力大小差異應用在胺基酸分子之分離。此外亦提供未知溶液與同學自行利用上述方法。實驗內容1.Ninhydrin反應2.LeadAcetate(醋酸鉛)反應3.Ehrlich重氮反應4.Millon反應5.TLC分離實驗步驟醣類鑑定生物工程系生化實驗本週實驗在利用簡單的化學反應區分醣類之結構特性，首先採用Molish試驗將醣類與其他生物大分子區別。而Seliwanoff反應(酫酮醣)、Barfoed反應(單雙多醣)、Schiff(AnilineAcetate)反應(5C、6C)則可針對各種結構特性於呈色型態、時間快慢等物理或化學性質加以鑑定。最後再以薄層層析法有機親和力大小差異應用在醣類分子之分離。此外本週提供未知溶液與同學自行利用上述方法組合設計出醣類分有效鑑定之流程，以達成生化分子結構之認知學習。實驗內容1.Molish反應(醣類)2.Seliwanoff反應(酫酮醣)3.Barfoed反應(單雙多醣)4.Schiff(AnilineAcetate)反應(5C、6C)5TLC分離實驗步驟生物工程系生物化學實驗蛋白質定量與電泳分析本實驗將以Lowry與Bradford法進行蛋白質定量實驗。另外，利用nativePAGE與SDSPAGE進行蛋白質電泳分離與分析，並鑑定個別蛋白質之分子量。LowryMethodBradfordMethodOD640nmOD595nm製作膠片電泳染色、褪染•計算Rf值•求各蛋白質分子量生物工程系生物化學實驗1.酵素反應速率測定0、5、10、15分鐘2.不同酵素濃度20、40、80l3.酵素最適反應pHpH4、pH7、pH104.酵素最適反應溫度20、37、50、70C5.抑制劑對活性的影響PMSF6.不同基質濃度5、10、15、20、30l50mM(BAPA)求Vmax、KmLineweaver-BurkplotEadie-HofsteeplotV0=-KmHanesplot酵素動力學分析本實驗將測定胰蛋白酶的反應速率及反應速率常數，同時將分析酵素濃度、基質濃度、pH值、溫度及添加抑制劑對酵素活性之影響。max0maxm01]S[11VVKvmax00][SVvmaxm0max00]S[1]S[VKVv總脂質/總膽固醇測定生物工程系生物化學實驗脂質未知液+濃硫酸Parafilm封口沸水加熱後冷卻計算總脂質脂質之測定法有很多種，磷酸香草素反應法，是最簡便、快速且正確地作比色測定，其原理為檢樣中之脂質於濃硫酸中加熱，經磷酸香草素之作用，產生粉紅色的發色染料。膽固醇的測定，以冰醋酸及醋酸酐為溶媒及脫水劑，濃硫酸為脫水劑及氧化劑，金屬離子(Fe2+，Al3+，Co2+)為催化劑，或加熱至80-95C來催化反應。總脂質測定前處理：呈色反應：未知處理液+磷酸香草素呈色試劑靜置30分鍾OD530測定吸光值總膽固醇測定膽固醇未知液+Isopropanol稀釋加醋酸加三氯化鐵加硫酸溫和轉動混勻靜置10~15分鐘OD560測定吸光值計算總膽固醇質體DNA萃取/PCR/核酸電泳分析生物工程系生物化學實驗使用Geneaid的High-SpeedPlasmidMinKit抽取質體PCR放大目標片段電泳分析本實驗以Geneaid質體抽取套組(鹼性裂解法)，從E.coli抽取含有beta-glucosidaseII基因之質體pBARGEM7-2，再使用PCR方法放大目標基因片段，並以瓊膠(agarosegel)電泳來作確認，其目的在使學生熟悉重組基因操作之基本技術。