生物化学实验指导

生物化学实验指导生命科学学院编著生物化学课程组2008年3月湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导1目录前言···························································································································2生物化学实验守则········································································································3实验一实验基本知识及溶液的配制··········································································5实验二蛋白质及氨基酸的呈色反应··········································································9实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应·································································13实验四蛋白质的定量测定方法················································································17实验五离子交换柱层析法分离氨基酸·····································································25实验六凝胶层析法和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定··········27实验七酶的特性········································································································34实验八底物浓度对酶促反应速度的影响·································································38实验九酪氨酸酶的提取及其催化活性研究·····························································40实验十核糖核酸的提取与组分鉴定及核酸含量的测定·········································44实验十一果蔬维生素C含量测定及其分析······························································47实验十二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较·····························································50实验十三脂肪酸的β－氧化······················································································53实验十四氨基移换反应（一）——血液中转氨酶活力的测定·····························55实验十五氨基移换反应（二）――谷丙转氨酶活性的鉴定·································57实验十六发酵过程中无机磷的利用········································································59参考文献······················································································································62湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导2前言近几年来，随着生物化学学科的迅猛发展，教学内容更新较快。生化实验被作为主干基础课列入了高等院校生命科学各专业的教学计划中，并且实验课单独作为一门课程开出。为了提高教学水平，反映出本学科更具科学性、先进性和实用性的实验内容，根据教学大纲的要求和课程设置，同时根据本校教学实验条件，在参阅中外相关文献，学习兄弟院校的教学经验和资料的基础上，编写了本实验讲义。本书为本校生命科学学院相关专业生物化学实验指导书，同时可作为其他相关专业学生参考。书中引用了其他作者部分内容，在此致以诚挚的谢意。编者2008.3湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导3生物化学实验守则一、生物化学实验课的目的和要求生物化学实验的方法和技术是生物科学以及其它相关研究领域中的一个非常重要的基础性实验课程。通过生物化学实验这门课程的学习，能使学生掌握生物化学实验的基本操作及实验技术，掌握生物大分子的分离纯化﹑定性﹑定量﹑化学性质﹑生物活性的鉴定，掌握和了解组织代谢和能量释放转变和贮存与代谢调节过程中的代谢产物和中间产物的定性﹑定量分析鉴定实验，使学生分析问题和解决问题的能力及实验动手能力得到训练，并能熟练掌握各种生物化学实验仪器的使用以及准确详实记录实验现象和数据等各项实验技能。本课程能培养学生严谨的科学态度和工作作风，为他们今后参加科研工作打下坚实的基础。二、实验的进行程序和要求1．预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。2．讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。3．独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。4．示教每次的实验都备有示教内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。5．作业实验报告必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。学生应认真阅读教师批改后的实验报告，不断提高实验质量。6．小结实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。三、实验规则和注意事项1．每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。2．上实验课时必须携带实验指导、实验报告纸及绘图文具等，按规定座位入座。3．实验前，要认真检查所用仪器、药品是否完好、齐备，如有缺损应及时向教师报告，自己不得随意调换标本、仪器等。没有得到教师的允许，不能动用实验室其它非本次实验所用的仪器设备。4．实验时要遵守纪律。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧哗，不准在实验室吃食和会客。5．实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。使用显微镜检查非永久片时，要特别小心。防止染料或试剂沾污镜头和镜台，不要用高级显微镜观察非永久片。操作要正规，观察要认真仔细，及时完成实验报告。6．要爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导4即报告，并主动登记、说明情况。凡是有化学药品的试剂和溶液瓶上，必须贴上标签，注明名称、成份、浓度、配制日期。7．实验结束后，应清理实验台面，所有液体废物、酸类、染料等，应倒在废物缸内，不能倒在水槽中。认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导5实验一实验基本知识及溶液的配制【课前预习】1．怎样使用电子分析天平？2．溶液的配制步骤有哪些？【目的要求】掌握实验基本知识和溶液的配制方法。【基本原理】溶液的配制步骤：计算，标量，溶解，定容，储存。【实验用品】1．材料：2．器材和仪器：烧杯，容量瓶，量筒，玻璃棒，试剂瓶。3．试剂：NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O。【方法步骤】（一）溶液的配制步骤（一）实验准备1准备所需的药品和玻璃仪器。2洗涤。（二）计算1百分比浓度计算：（1）G/V比如：配1%NaCl,称1gNaCl溶于100mL水。（2）V/V比如：配75%乙醇100mL，乙醇100mL×75%=75mL，蒸馏水25mL。（3）G/G比用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。2摩尔浓度的计算：(药品的分子量一般在标签中注明)M=摩尔数(mol)/体积(L),摩尔数（mol）=G(g)/摩尔质量1M=1mM×1000=1µM×1000000例如：0.1M或0.1mol/LNaCl配100mL：称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g。3混合溶液配制的计算：如配3µMEDTA,2.25mMNBT以及60µM核黄素100mL，用50mM磷酸缓冲液配制。注意：分别计算三种成分的质量；用磷酸缓冲液分别配制三种成分的溶液，再混合，使混合后的总体积为100mL。湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导6（三）标量1根据需要选择不同量程的天平；根据要求选择不同的测量器，如量筒或移液器。2电子分析天平的使用:开启、预热（1小时），调水平；校准CAL;称量将量器（称量纸，称量杯等）归零去皮(Tare或T.O)后，慢慢加样至量器，当加试样与指定量相差不到10mg时，极小心地将盛有试样的药勺伸向量器的正上方2-3cm处，勺的另一端顶在掌心上，用拇指、中指及掌心拿稳药勺，并以食指轻弹勺柄，将试样慢慢的抖入量器中。多加的药品取出，但不能返回试剂瓶中。（四）溶解1根据药品配制的要求选择溶剂：如：蒸馏水，双蒸水，无离子水等。2只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净。（相似相溶原理）（小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性质和分子式，可根据分子式和所学的常识来判断药品的结构和性质的特点。）配制酸碱两性物质（氨基酸，蛋白质，核苷酸等）时，如果溶解性不好，可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。加热可以促进溶解，但注意应该在配制的范围内。如配0.1%的淀粉，水浴加热（温度在80-90℃），过量会糊化。（五）定容1固体先于小烧杯中加少量溶剂溶解，不溶时可稍加热（前提是溶质耐热），冷却后移到容量瓶中，用玻璃棒引流或用小漏斗，将小烧杯多洗几次。用溶剂加入到将容量瓶2/3时，将容量瓶水平方向摇动几周（勿倒置），使溶液大体混刀。在慢慢加溶剂到标线1cm左右，等1-2分钟，然后用滴官伸入瓶颈接近液面处，眼睛平视标线，加溶剂至液体凹与标线相切，盖瓶塞倒转，使气泡升到顶，将瓶震荡数次，再倒置，重复操作10次以上，才能混合均刀。（注意：不再定容了，防止溶液漏掉）2液体稀释用移液管移取一定体积的溶液于容量瓶中，再按上法进行。如果稀释时产生热量，可先于小烧杯中加少量溶剂溶解，冷却后移到容量瓶中，再按上法进行。用容量瓶定容后，装入试剂瓶，帖上标签。标签应注明以下内容：药品浓度，名称，配制人和日期等。（六）清理实验场所。（二）缓冲溶液的配制1概念由一定物质组成的溶液，在加入一定量的酸或碱时，其氢离子浓度改变甚微或基本不变，此种溶液称为缓冲溶液；这种作用称为缓冲作用；其溶液内所含物质称为缓冲剂，调节缓冲剂的比例可以配置成各种pH的缓冲液。缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐。调节二者的比例可以配制成各种pH的缓冲液。湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导7例如：某一缓冲液由弱酸（HA）及其盐(BA)所组成，它的解离方程式如下：HA≒H﹢﹢A﹣BA≒B﹢﹢A﹣若向缓冲液中加入碱（NaOH）,则HA﹢NaOH→NaA+H2O弱酸盐若向缓冲液中加入酸（HCl）,则BA﹢HCl→BCl﹢HA弱酸由此可见，向缓冲液中加酸或碱，主要的变化就是溶液内弱酸（