生物化学实验讲义

生物化学实验讲义内蒙古科技大学生物与化学工程学院基础生物教学部2010年1月目录实验一氨基酸的分离鉴定—纸层析法…………………………………………2实验二琼脂糖电泳法分离DNA………………………………………………...3实验三乳中酪蛋白的分离……………………………………………………….5实验四3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖…………………………………….6实验五蛋白质等电点测定和沉淀反应………………………………………….8实验六蛋白质的定量测定……………………………………………………...11实验七多酚氧化酶的制备和化学性质………………………………………...12实验八影响多酚氧化酶作用的各种因素……………………………………...14实验九醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸………………………………………...16实验十维生素C的定量测定…………………………………………………...18实验十一SDS凝胶电泳法测定分子量……………………………………………20附录一生物化学实验室规则…………………………………………………...23附录二实验室安全及防护知识………………………………………………...241实验一氨基酸的分离鉴定—纸层析法一、实验目的1.学习纸层析法的基本原理和操作技术2.掌握氨基酸Rf值的计算方法3.掌握通过已知氨基酸对未知氨基酸和未知混合氨基酸组分进行鉴定二、实验原理层析法又称色层分析法，根据支持物的不同分为吸附层析、离子交换层析、分配层析。纸层析是常用的、经典的分配层析技术，支持物是滤纸，固定相是水，流动相为有机溶剂。将样品点在滤纸上（这点称为原点），用扩展剂进行展层时，样品中各种的溶质即在两相溶剂中不断的进行分配，由于个溶质在两相溶剂中的分配系数a（a=溶质在流动相中的溶解度/溶质在固定相中的溶解度）不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，从而将其分离开来行程距离不等的层析点。溶质在滤纸上的位置可用比移值（Rf）表示：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到扩展剂前沿的距离对同一溶质来说，层析条件不变Rf是一常数，所以可以利用溶质的Rf值做出定性分析。根据Rf值可以用已知氨基酸鉴别未知氨基酸和混合氨基酸的组分。三、实验材料、试剂和仪器1.材料、试剂（1）扩展剂将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分震荡，静置后分层，放出下层水层。将漏斗内的扩展液放入磨口瓶中备用。（2）氨基酸溶液：0.5%赖氨酸；0.5%脯氨酸；0.5%缬氨酸；赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸混合溶液各组分的浓度均为0.5%。（3）显色剂：0.1%水和印三酮正丁醇溶液2.仪器：培养皿；滤纸；表面皿；毛细管；喷雾器四、操作步骤1.取直径12.5cm圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在每条线上距圆心0.5cm处做标记（画一个点）并分别在其边缘上标上赖、脯、缬、混等字样。2.用毛细管分别蘸取测定液各一滴，在滤纸的样应点样。等一次点样干了之后再点一次，重复2—3次，点样直径不超过3mm。3.用小枪头或其它在滤纸圆心扎一小孔，另取滤纸将其卷成筒状，捻紧如灯芯，底部用剪刀剪成碎条状，从滤纸的点样背面插入小孔，突出滤纸面约0.5cm。4.在表面皿中加入约3ml扩展液，再将其放入培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯浸入到扩展液中，盖上培养皿，待扩展剂距边缘1cm时，即可取出停止层析。用铅笔画出扩展液前沿后，吹干或烘干。5.将滤纸平放在表面皿上，喷雾0.1%水和印三酮正丁醇溶液再吹干或烘干，观察层析出现的弧形紫色斑。用铅笔标出原点到层析点中心的距离和到扩展液前沿的距离，计算Rf值。2实验二、琼脂糖电泳法分离DNA一、实验目的1.掌握琼脂糖电泳分离DNA的基本原理2.掌握电泳的基本操作和琼脂糖电泳在分离和鉴定DNA片段上的应用二、实验原理琼脂糖电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的主要方法，该技术操作简便、快捷，且可直接用溴化已啶进行染色，确定DNA在凝胶中的位置。在紫外灯下观察DNA条带，DNA的检出范围为1—10ng。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种现状高聚物，加热至90℃左右时，即可形成清亮透明的液体，灌在模板上冷却后固化形成凝胶，使用不同浓度的琼脂糖可以制成各种不同分辨率能力的凝胶，琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要是依据它们的分子大小和分子形状。同时与凝胶浓度也有密切关系，不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离的DNA片段见下表。核酸分子带负电，在电场作用下DNA分子由负极向正极移动，在一定浓度的凝胶中较小的DNA片段迁移的速度比较大片段快。DNA片段迁移距离与其分子量对数成反比。因此通过已知大小的标准物质的迁移距离与未知的片段迁移距离进行比较，便可测出未知片段的大小。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大，其共价闭环DNA＞线状DNA＞开环的双链环形DNA。除凝胶浓度外，电压大小、缓冲液组成及离子浓度也影响DNA分子的迁移速度和电泳分辨率。琼脂糖凝胶浓度（%）可分辨的线性DNA（kb）0.620—10.710—0.80.97—0.51.26—0.41.54—0.22.03—0.1三、实验材料、试剂和仪器1.材料、试剂（1）琼脂糖（2）电泳缓冲液（储存液）5*TBE：每1000ml含54gTris；27.5g硼酸；20ml0.5M的EDTA(pH8.0)（3）电泳工作液：0.5*TBE(4)上样缓冲液：0.25%溴酚兰和40%蔗糖水溶液（5）样品DNA2.仪器：电泳仪和水平电泳槽；紫外投射发射分析仪；胶带纸；微波炉四、操作步骤1.用胶带将干净，干燥的制胶板两端开口封好，在制胶板里放置好梳子并把电泳槽水平放在工作台上。2.用0.5TBE电泳缓冲液配制0.8%琼脂糖溶液，冷却至大约60℃，倒入制胶板中，胶的厚度约为3—5mm，倒胶时要避免产生气泡，若有气泡立即用滴定管在胶尚未凝固时吸去。3.待胶凝固后，小心移去梳子和胶带，将制胶板连同凝固的琼脂糖胶放入电泳槽3中。4.加入电泳缓冲液，使液面高出胶面约1—2mm。5.将样品与缓冲液按5：1混合，对每个上样孔取样品5ul加入1ul上样缓冲液混合后全部加入即可。注样品孔应处于负极端。6.盖上电泳槽盖子，打开电泳仪开关，调节输入电压为5—10伏/厘米。7.电泳完毕后，切断电源，取出凝胶放入EB液中染色20min.用清水漂洗后，在紫外灯下观察结果。4实验三、乳中酪蛋白的分离一、实验目的掌握从乳中制备酪蛋白的原理和方法二、实验原理酪蛋白是乳中存在的主要蛋白质，含量约为35g/l，酪蛋白不是一中简单的蛋白质，而是一些含磷蛋白质的混合物。在某一pH值下，氨基酸分子所带正负电荷相等，本身呈电中性。这时溶液的pH值称为氨基酸的等电点。氨基酸在其等电点时溶解度昀小，易发生沉淀。利用这一性质将牛乳pH值调到4.8，酪蛋白即可沉淀出来，酪蛋白也不溶于乙醇，利用这一性质可以从酪蛋白粗制品中去掉不需要的脂类物质。三、实验材料、试剂和仪器1.材料、仪器牛乳；100℃温度计；细布；布氏漏斗和滤纸；烧杯；量筒；玻璃漏斗；电炉；抽滤瓶；pH试纸。2.试剂醋酸钠缓冲液（0.2N，Ph4.6）；95%乙醇；乙醚；乙醚：乙醇=1：1四、操作步骤1.把100ml牛乳放入一个500ml烧杯中，并加热至40℃在搅拌下慢慢加入100ml40℃的醋酸钠缓冲液。2.混合液的昀终pH应为4.8，可用pH计校正。3.将上面悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布或纱布过滤。4.所得沉淀用少量水洗几次，然后悬浮于大约30ml乙醇中。5.将上述悬浮液倾入布氏漏斗中过滤，然后用等体积的乙醇和乙醚混合液洗两次。6.昀后，用50ml乙醚洗沉淀并抽干。7.将沉淀从布氏漏斗中移去，摊开在表面皿上待乙醚挥发即得酪蛋白纯品。四、计算算出每百毫升牛乳中酪蛋白的含量（%）。若以3.5%为理论产量，算出回收率（%）。5实验四3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖一、实验目的1.掌握还原糖定量测定的原理和方法2.掌握分光光度计的使用二、实验原理还原糖的测定是糖的定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。单糖均为还原性糖，双糖不一定是还原性糖其中乳糖和麦芽糖为还原性糖，蔗糖和淀粉为非还原性糖。利用糖的溶解度不同，可将样品中的单糖、双糖、多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定。再分别求出样品中还原糖和总糖的含量。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及产物，3，5—二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3—氨基—5—硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。三、实验材料、试剂和仪器1.材料、仪器小麦面粉；pH试纸；容量瓶；玻璃漏斗；移液管；量筒；试管；恒温水浴锅；沸水浴锅。2.试剂（1）6mol/lHCl和6mol/lNaOH溶液各100ml；（2）碘—碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。（3）1mg/ml葡萄糖溶液准确称取80℃烘干恒重的分析纯葡萄糖100g，置于小烧杯中加入少量蒸馏水溶解后，移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定溶至100ml，混刀，4℃冰箱中保存备用。（4）3，5—二硝基水杨酸把6.3g3，5—二硝基水杨酸溶于262ml2mol/l的氢氧化钠中将此溶液与500ml含有182g酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，充分搅拌溶解待溶液冷却后，用水稀释到1000ml，存储于棕色瓶中。四、操作步骤（一）葡萄糖标准曲线的绘制1.按下表制备9个管管号葡萄糖存储液（1mg/ml）ml水ml葡萄糖昀终浓度（ug/ml）100.5020.050.4510030.10.420040.150.3530050.20.340060.250.2550070.30.260080.350.1570090.40.18002.向九支试管中分别加入0.5mlDNS试剂，充分混合。63.将九支试管放入沸水浴中加热煮沸5min。4.将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。5.向试管中分别加入4ml蒸馏水，充分混合。6.以空白试管试管作对照，于540nm波长下，分别测定各管OD值并记录。7.以每管的吸收值即OD值为纵坐标，相对应管的葡萄糖浓度为横坐标作图，得到一条直线，该直线通过零点。（二）还原糖抽提液的制备1.称取2g小麦粉，把它放入一个100ml的烧杯中，然后加入50—60ml蒸馏水，搅拌均刀。2.把烧杯放入一个50℃水浴中保温30min。3.拿出烧杯，将烧杯内含物转入一个100ml容量瓶中，加水至刻度，充分混刀，过滤之，（滤出液用于测定还原糖）即得还原糖抽提液。（三）样品的酸水解和总糖抽提液的制备1.把1g小麦粉溶于15ml水中并加入10ml6N的盐酸溶液混合。2.将烧杯放入沸水浴中加热煮沸30min3.拿出烧杯，冷却之。4.加入6N的氢氧化钠中和烧杯内含物。5.将中和后的溶液转入一个100ml的容量瓶中，加水至刻度，充分混刀。6.将容量瓶中的溶液过滤7.取1ml滤出液加水至10ml，即得总糖的抽提液。（四）小麦样品中总糖和还原糖的测定1.取五支试管，编号分别为1—5按下表向每支试管中加入试剂。2.用试管1作对照，测定每管在540nm下的OD值，将结果记录表中。管号试剂12345还原糖抽提液（ml）00.50.500总糖抽提液（ml）0000.50.5DNS(ml)0.50.50.50.50.5水（ml）4.54444OD5403.根据还原糖和总糖的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算还原糖和总糖的百分含量：即：还原糖%=从曲线查出还原糖浓度*N*100*2/样品重mg数总糖%=从曲线中查出总糖的浓度mg/ml*N*100*0.9*2/样品重mg数N:稀释倍数注：由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一个水分子，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。7实验五蛋白质等电点测定和沉淀反应一、蛋白质的等电点测定1.实验目的（1）了解蛋白质的两性解离性质。（2）学习测定蛋