生物化学课件 第五章蛋白质的共价结构

第五章蛋白质的共价结构1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:primarystructure一级结构：氨基酸序列secondarystructure二级结构：α螺旋，β折叠tertiarystructure三级结构：所有原子空间位置quanternarystructure四级结构：蛋白质多聚体1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。蛋白质的结构层次蛋白质结构层次肽基的C、O和N原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转形成酰胺平面产生键的平均化肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体历史上第一个被确定氨基酸序列的蛋白质胰岛素insulin胰岛素的历史第一个生化药物•最小的蛋白质，由A链(21AA)和B(30AA)组成；动物胰腺ß细胞分泌的一种激素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；•1921年Banting&Best从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，1923年Banting&Macleod获Nobel医学奖；•1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；•1981年，Berg（因DNA重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素.蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化2、测定蛋白质分子中多肽链的数目3、亚基分离4、二硫键的拆分与保护5、分析每一多肽链的氨基酸组成6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基7、多种方法的部分水解8、测序9、重叠10、二硫键位置的确定一级结构测定策略蛋白质一级结构测定步骤N端的测定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色)++HF弱碱中氨基酸Sanger试剂(FDNB)标记N末端Sanger试剂标记反应ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E12345结论：ABCDEFDNBFDNB完全水解部分水解Sanger试剂标记测序H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高酰化反应氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中(400C)(硝基甲烷400C)H+Edman降解法(I)DABITC：有色Edman试剂在Edman试剂上加发色基团Edman降解法1Edman降解法(II)Edman降解法2无冕英雄PehrVictorEdman•瑞典人,1916.4.14-1977.3.19•1946-47年在美国留学时想到改进1930年Abderhalden&Brockmann发明的PITC试剂的反应,50年发明Edmandegradation反应.ActaChemScand4:283(1950)1957年移居墨尔本,远离国际学术中心开始过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度;他坚持不申请专利,给了美国公司得以随便开发仪器的方便.1972年到德国,77年因脑瘤过世.•由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测,只有HPLC和相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用该反应测定了RNase的一级结构,遗憾的是Edman没有和他们分享Nobel化学奖.1、肼法2、还原法3、酶降解法C端的测定方法蛋白质与无水肼加热-------NH-CH-CONH-CH-COOH||RxRy--+--+NH-CH-CONH-NH2+NH2-CH-COOH||RxRy肼(hydrazine)法测定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有机溶剂而被除去多种方法确定肼法C端测定利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。酶解法末端测序酶解法末端测序肽键的专一性水解(化学法)化学法:BrCN,H+,NH2OH,etc化学法专一性水解消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）泛用酶：胰蛋白酶（trypsin）；Lys-X,Arg-X(X≠Pro)胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;X≠Pro)嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；木瓜蛋白酶（papain）；X-Y(X=R,K,Q,H,Y)胃蛋白酶（pepsin）；枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）专一酶：Lys-X;X-Lys;Arg-X;Glu-X;X-Asp;Pro-X;Asn-X,商品名：EndoproteinaseAsn-C肽键的专一性水解(酶法)酶法专一性水解氨基酸的鉴定、分离纯化PTH-AA氨基酸的确定太短在多肽链中次序的决定•资料：N-末端残基H,C-末端残基S;•第一套肽段第二套肽段•OUSSEO•PSWTOU•EOVEVERL•RLAAPS•HOWTHO•借助重叠肽确定肽段次序：•末端残基HS•末端肽段HOWTAPS或•OUS•第一套肽段：HOWTOUSEOVERLAPS•第二套肽段：HOWTOUSEOVERLAPS•推断全序列:HOWTOUSEOVERLAPS二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。胰岛素-巯基乙醇碘乙酸二硫键的断裂确定原多肽链重二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。二硫键的切割与保护1、过甲酸〔performicacid〕不可逆－CH2SO3H2、还原＋烷基化不可逆[巯基乙醇，DTT]＋碘乙酸等－S-CH2-COOH二硫键的保护1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先将自由SH基封闭;2、进行专一性部分水解;3、纸层析分离水解产物;4、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层析;5、将迁移率发生变化的多肽进行测序经典的二硫键位置的确定法二硫键位置确定对角线电泳示意图现用蛋白质一级结构分析方法分离纯化蛋白质酶切部分水解后分离短肽对短肽进行测序构建cDNA文库根据序列设计探针筛选cDNA文库根据cDNA序列推测蛋白质的一级结构N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。末端测序的用途常利用蛋白质数据库//蛋白质氨基酸顺序与生物功能研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。例1镰刀形贫血病患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于β链的N-末端第6位残基发生了变化（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性蛋白质一级结构的个体差异例2一级结构的局部断裂与蛋白质的激活体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原•前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.•信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。•胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.黄色：不变残基（invariableresidues）蓝色：保守氨基酸（conservativeresidues）未标记：可变残基（variableresidues）不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素细胞色素c分子的空间结构不变的AA残基38个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44