生物技术---免疫学技术

生物技术---免疫学技术基本概念抗原（antigen）：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质分完全抗原和半抗原抗体(antibody)：抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白第三章免疫学技术基本概念抗原的制备：颗粒抗原、半抗原、人工抗原抗体的制备：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体第三章免疫学技术--抗原抗体反应可对抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测抗体抗原以非共价键结合不可见反应：几秒-几分钟可见反应：数分钟（小时、日）影响因素电解质温度酸碱度第三章免疫学技术酶联免疫法放射免疫法荧光免疫法其他第三章酶联免疫法（enzymeimmunoassay)以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应酶结合物应具有双功能：高度特异的免疫反应、生物催化放大作用基本方法间接法双抗体夹心法竞争法生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）某些新进展酶联免疫吸附（enzymelinkedimmunosorbentassay）间接法1、将已知可溶性抗原吸附于载体2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗体的待检液4、温育后清洗5、加入酶标记的二抗6、温育后清洗7、加入酶作用底物8、测定反应颜色深浅双抗体夹心法1、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液4、温育后清洗5、加入酶标记特异性抗体6、温育后清洗7、加入酶作用底物8、测定颜色反应深浅酶联免疫吸附（enzymelinkedimmunosorbentassay）竞争法1、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液4、温育后清洗5、加入酶作用底物6、测定颜色反应深浅酶联免疫吸附（enzymelinkedimmunosorbentassay）生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem）基本概念生物素：是一种维生素H，经活化后，可与抗体、抗原、酶以多配一的方式共价结合，且不影响它们的活性亲和素：从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可与酶偶合，以1配多的方式对生物素有很强的亲和力BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法BA法ABC法酶联免疫吸附（enzymelinkedimmunosorbentassay）酶联免疫吸附（enzymelinkedimmunosorbentassay）均相酶免疫测定法无需“固定在载体上”；无需“温育后清洗”斑点免疫结合试验以微孔薄膜为载体，酶免疫反应阳性结果在膜上出现色斑点胶体金标记较酶标记更为简便酶联免疫吸附（enzymelinkedimmunosorbentassay）猪肉和尿液盐酸克伦特罗的免疫胶体金法快速检测瘦肉精中毒事件2000年以来，内地相继发生18起瘦肉精中毒事件，中毒人数达1700多人，死亡1人（不包括上海2006年集体中毒事件）瘦肉精残留及危害不容忽视，瘦肉精替代品暗潮涌动上海9.13瘦肉精食物中毒事件（2006年）“瘦肉精”学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常用于治疗哮喘。由于盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长,提高瘦肉率,所以养殖户称其为“瘦肉精”，曾在国内外广泛用于动物饲养生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，个别会出现腿抽搐，站不稳，爬坡困难；宰后猪的肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄瘦肉精介绍瘦肉精介绍“瘦肉精”化学性质特别稳定，加热到170℃时才能被分解，故一般家庭厨房加热不能将其分解破坏食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状违法者使用该物质以提高猪的瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情的市民错误地认为这样的肉才是“好肉”而特别喜欢选购《食品卫生法》《食品添加剂卫生管理办法》（GB2760）《动物性食品中兽药残留最高限量》（农业部公告第235号，2002年12月24日）规定：禁用药物，动物性食品中不得检出：瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等31种违法者的法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处罚法律规定盐酸克伦特罗残留检测方法《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》（GB5009.192-2003）第一法：气相色谱——质谱法，检出限：0.5ppb第二法：高效液相色谱法，检出限：0.5ppb第三法：酶联免疫法（ELISA筛选法），检出限：0.5ppb《动物组织中盐酸克伦特罗的测定——气相色谱/质谱法》（NY/T468－2006），检出限：2.0ppb《动物尿液中盐酸克伦特罗的测定——气相色谱/质谱法》（NY/XQ421－2003），检出限：1.0ppb《尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法（NY/T933-2005），检出限：3.0ppb猪肉全程监控中瘦肉精检测方法的选择生猪饲养屠宰场大型批发市场零售市场饲料检测猪尿检测猪尿检测猪肉检测猪肉检测猪肉检测酶联免疫法免疫胶体金免疫胶体金酶联免疫法免疫胶体金筛检阳性GC-MS确认大型仪器确认政府部门监督抽检GC-MS餐饮业猪肉检测免疫胶体金销毁和溯源阳性GC-MS确认大型仪器确认阳性免疫胶体金快速检测板的外观图免疫胶体金快速检测板(试剂)的结构图检测原理盐酸克伦特罗快速检测试剂板的中央膜面上固定有两条隐形线，克伦特罗抗原固定在测试区作为检测线（T线），二抗固定在质控区作为对照线（C线）。当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩散。如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和胶体金颗粒上的抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至T线时，胶体金颗粒上抗体活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T线上药物抗原结合；所以当样品中盐酸克伦特罗含量1ppb(检测限)以上时，试剂板上的T线将较C线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在1ppb以下或无残留时，试剂板上的T线显色与C线相近或偏深，判定为阴性灵敏度肉样或组织样：1ppb(标准前处理)或5ppb（简单前处理）尿样：1ppb(标准前处理)特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药物没有交叉反应；准确性：与瘦肉精ELISA试剂盒的检测结果符合率90％有效期：半年（冷藏闭光保存）胶体金免疫层析法检测瘦肉精的技术指标操作步骤于5ml离心管中加入5g左右剪碎或是高速匀浆过的猪肉组织样，盖紧管盖1将装有样品的离心管在90℃以上水浴锅中加热10分钟加热完成后取出冷却至室温；可以明显看到底部有溶液渗出32吸取3滴（约100ul）煮出的样品渗出液到1.5ml的离心管中4操作步骤吸取3滴（约100ul）盐酸克伦特罗组织样专用稀释液到1.5ml离心管中。充分混合均匀从包装铝箔袋中取出检测卡平放。吸取3滴（约100ul）混匀溶液加入到试剂板加样孔中567样液滴入加样孔后开始计时，5～10分钟左右判定结果