生物技术原理与方法(基因工程)

生物技术原理与方法浙江大学生物技术研究所胡东维主要讲课内容一、概论(3学时)二、基因工程(9学时)三、细胞工程(3学时)四、发酵工程(1学时)五、酶工程(2学时)一、基因工程原理与方法基因克隆的基本原理基因工程的工具－－酶基因工程载体基因文库转基因技术转基因策略一、基因的结构与表达调控•真核生物与原核生物基因的结构一、基因的结构与表达调控•真核生物与原核生物基因的结构原核生物结构基因的组成多数以操纵子形式存在，多个基因转录；但往往分别翻译。无内含子结构。一、基因工程原理•应用实例1。利用Bt基因防治棉铃虫Bt是苏云金杆菌的晶体蛋白，具有高度特异性杀虫活性。在昆虫消化道内降解成为活化毒性肽，导致昆虫死亡。该基因无内含子结构；但与真核生物的编码嗜好不同。一、基因工程原理•应用实例1。利用大麦抗病基因(Mla)提高植物抗病性Mla是大麦的叶绿体蛋白，可增强对白粉病菌抗病性。Mlo的DNA约3700bp，具有11个内含子。cDNA是可利用的方式基因工程的基本原理基因工程的基本原理二、基因工程工具酶和DNA加工基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加工、连接等。DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。二、基因工程工具酶和DNA加工基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加工、连接等。DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。二、基因工程工具酶和DNA加工1.DNA切割1.1限制性内切酶(restrictionendonuclease)类型：即I、II/III型酶。真正有用的是II型酶。命名：属命＋种名＋菌株＋顺序号HindIII；EcoRI；BamHI。至今已发现上千种限制性内切酶，常用的有几十种。特异性：4－6碱基的识别位点HpaII：C’CGGEcoRI：G’AATTCBamHI：G’GATCCAhaIII：TTT’AAA二、基因工程工具酶和DNA加工1.DNA切割1.2DNaseDNaseI无识别的内切酶，可产生大小均一的片段。1.3物理方法利用超声波；振荡、加压等。二、基因工程工具酶和DNA加工2.DNA的修饰Phosphatase去除DNA末端的5’P，防止分子间的连接。Polymerase补平DNA双链；合成DNA和RNA分子。Exonucleases补平DNA双链Methylase保护内切酶位点的降解二、基因工程工具酶和DNA加工3.DNA的连接类型平端连接与粘端连接。酶T4DNAligase：平端连接与粘端连接E.coliDNAligase：粘端连接三、简单的基因克隆策略克隆已知基因或其同源基因片段DNA的提取PCR方法扩增特异性片段插入载体上转化细菌筛选重组子三、简单的基因克隆策略mRNA提取cDNA的合成PCR扩增特异性片段转化细菌筛选重组子四、基因文库•基因组文库：Genomiclibrary包含所有基因组DNA片段重组子的总和。多用于基因结构研究。•cDNA文库：cDNAlibrary(Expressionlibrary)包含所有cDNA分子的重组子的总和。多用于基因表达产物，即基因功能的研究。四、基因文库1.基因组文库的构建：基因组DNA的提取基因组DNA的消解(随机)补平插入载体(连接)扩增载体类型：l噬菌体：23kb粘粒：37－52kbBAC(细菌人工染色体)：350kbYAC(酵母人工染色体)：1mb四、基因文库2.cDNA文库的构建：总mRNA的提取反转录cDNA合成插入l噬菌体载体(连接)转化进入细菌扩增载体类型：lZAP噬菌体：23kb四、基因文库3.基因组文库的筛选基因组文库培养DNA探针或蛋白抗体探针筛选挑单斑测序鉴定五、PCR原理与方法一般30－40个循环。单分子的理论扩增可达109。六、常用载体的种类与结构1.质粒载体Plasmidori：复制起点Ampr、Tetr：抗性筛选基因适宜的克隆位点适当的拷贝数六、常用载体的种类与结构1.质粒载体Plasmid六、常用载体的种类与结构1.质粒载体Plasmid六、常用载体的种类与结构2.噬菌体载体phagevector六、常用载体的种类与结构2.噬菌体载体phagevector六、常用载体的种类与结构3.粘粒载体cosmid（重组子37－52kb）六、常用载体的种类与结构4.酵母人工染色体yeastartificialchromosomse(YAC)CEN4，4号染色体的着丝粒TEL，端粒ARS，自主复制起点TRP1和URA3，酵母选择标记SUP4，蓝白斑标记七、原核生物的转化（transformation）感受态细胞(competentcells)能够接受外源DNA的寄主细胞。一般利用热激和冷激的方法改变细胞壁和质膜的结构，使其成为感受态细胞。典型步骤：细菌培养离心收集加入CaCl2溶液悬浮42℃热激冰上冷激－20保存备用。转化(transformation)将外源DNA导入原核细胞内部的方法。将重组DNA与感受态细胞混合，冷激，即可完成转化。八、真核生物转化根癌农杆菌法/Ti质粒法转化植物农杆菌可以侵染植物细胞，其Ti质粒可以整合到植物细胞的染色体上。步骤：将目的基因克隆到Ti质粒上转化到农杆菌中利用农杆菌侵染植物组织组织培养筛选重组子。将目的基因克隆到Ti质粒上Ti质粒包被钨弹利用基因抢直接打入植物细胞组织培养筛选重组子。八、真核生物转化电击穿孔法(electroporation)：制备原生质体高压电击DAN转移基因枪法(genegun)：DNA包裹金属弹轰击真核细胞。用气体或炸药做动力。PEG介导转化法：在PEG和CaCl存在下的转化原生质体。显微注射法(micro-injection)：毛细管直接注射动物细胞或原生质体花粉管通道法：DNA沿花粉管通道直接进入胚囊。病毒介导的转化：重组病毒先插入农杆菌T－DNA，或直接侵染其中电击穿孔法、基因枪法和PEG最为成功九、转基因生物的检测1.凝胶电泳生物大分子在电场作用下在凝胶中的运动。电压一定时，凝胶浓度决定了大分子运动的速度；相对来说，分子量越大，运动速度越慢。2.大分子杂交DNA/DNA、DNA/RNA、蛋白/蛋白、蛋白/核酸大分子电泳转移到尼龙膜上与放射性探针杂交九、转基因生物的检测1.Southern检测检测DNA。检测目的基因是否插入整合到寄主染色体上。多使用放射性DNA探针。2.Northern检测检测mRNA。检测基因的表达。多使用放射性DNA探针或放射性RNA探针。3.Western检测检测蛋白。检测基因的表达。使用目的基因蛋白的抗体。十、转基因技术在农业上的应用1.植物抗虫基因工程A.Bt蛋白基因的应用来源：原核生物苏云金杆菌(Bacillusthurgiensis)，革兰氏阴性菌原理：Bt蛋白降解产生对昆虫肠道具有毒性的多肽。基因修饰：保留毒性片段；修改编码习惯表达方式：强化表达；特异性表达在非食用部分转基因植物：番茄，棉花，水稻，大豆，玉米等十、转基因技术在农业上的应用1.植物抗虫基因工程B.雪莲凝集素基因的应用来源：高等植物，英国剑桥原理：雪莲凝集素蛋白对昆虫肠道细胞表面蛋白具有特异性凝聚作用。基因修饰：无需修饰表达方式：叶片和非人畜食用部分转基因植物：水稻，大豆，玉米，大麦，马铃薯等十、转基因技术在农业上的应用1.植物抗虫基因工程C.蛋白酶抑制剂基因来源：高等植物，特别是豆科植物原理：对昆虫肠道的蛋白酶活性起抑制作用，导致消化不良，营养匮乏死亡。基因修饰：无需修饰表达方式：叶片和非人畜食用部分转基因植物：水稻，大豆，玉米，大麦，马铃薯等主要作物十、转基因技术在农业上的应用2.植物抗病基因工程A.植物抗病毒病(基因工程疫苗)策略：抑制病毒结构基因表达转反义的病毒基因：外壳蛋白(CP)，移动蛋白(MP)，复制酶基因等RNAi技术：转入反向重复序列，产生发夹状RNA产物，从而抑制相应基因的表达。(基因工程疫苗)十、转基因技术在农业上的应用2.植物抗病基因工程B.植物抗真菌病害原理十、转基因技术在农业上的应用2.植物抗病基因工程B.植物抗真菌病害策略：通过激活信号传导途径强化植物防卫反应基因的表达强化植物防卫反应基因表达：外-1,3-葡聚糖酶，几丁质酶等转植物抗病基因：克隆抗病基因并转入植物中去强化表达。转录因子基因：希望调控防卫相关基因的表达。十、转基因技术在农业上的应用3.植物抗除草剂基因工程A.转耐除草剂基因从环境微生物中筛选耐除草剂基因，降解或修饰除草剂。bar基因(乙酰化酶)可使PPT乙酰化失去毒性。B.改造除草剂作用的靶蛋白不同除草剂的作用靶蛋白不同。修饰和改造靶蛋白基因的结构，可以提高对除草剂的抗性或耐性。将突变的EPES酶导入番茄，高抗草甘膦。策略：强化表达十、转基因技术在农业上的应用3.植物品质改良的基因工程A.增加蛋白含量转化高效表达的豆科植物储藏蛋白基因。B.改造植物脂肪种类不饱和脂肪酸合成相关的酶类。C.果实延熟与保鲜抑制有关乙烯合成酶。转反义基因序列。十、转基因技术在农业上的应用3.植物雄性不育的基因工程雄性不育系×恢复系雄性不育系×保持系杂交种子雄性不育系策略：细胞核光敏不育基因；线粒体育性相关基因