生物技术概论-基因工程(ppt137)(1)

生物技术概论基因工程南方医科大学生物技术学院马骊二〇〇六年五月十一日重组DNA技术的定义将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程的定义重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的理论基础不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件如启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列——分子生物学原理筛选、修饰蛋白质生物合成的翻译调控元件如SD序列、mRNA非编码区、密码子基因工程菌的增殖及稳定生产——生化工程学原理——分子生物学原理基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术基因工程的基本条件C目的基因B基因克隆载体A用于核酸操作的工具酶D用于基因转移的受体菌或细胞A用于核酸操作的工具酶限制性内切核酸酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性内切核酸酶一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P的DNA片段的内切脱氧核苷酸酶。基因工程中所用的是II型酶。属名种名株名HindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如：EcoRI的识别序列为：GAATTCCTTAAG1、限制性内切酶的识别顺序限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称为识别序列。识别序列多由4-6个核苷酸对组成，呈典型的旋转对称型回文结构。有的限制性内切酶可识别2种以上的核苷酸序列。如：AccI既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC在限制性内切酶的作用下，DNA双链上磷酸二酯键断开的位置称为酶切位点，用表示。酶切位点位于识别序列的内部或两侧。如：GAATTC、GATC。2、限制性内切酶的酶切位点不同的酶切割DNA分子后产生的末端不同：5’粘性末端、3’粘性末端、平末端。如：EcoRI产生5’粘性末端:5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’PstI产生3’粘性末端：5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PvuII产生平末端：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’同裂酶：有些限制性内切酶虽来源不同，但具有相同的识别序列，酶切位点不同或相同。如：BamHI和BstI：识别GGATCC。同尾酶：有些限制性内切酶虽识别序列不同，但酶切产生的DNA片段具有相同的末端。如：TaqI、ClaI和AccI，酶切均产生5’-CG末端。限制性内切酶酶切反应的操作大部分限制性内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100ulTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1hr，完全水解1mg标准DNA所需的酶量。限制性内切酶的多酶联合酶切对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。0.1倍体积的5MNaAcpH5.4；2.5倍体积的冰冷乙醇；冰浴5min、高速冷冻离心10min、干燥。影响限制性内切酶活性的因素DNA样品的纯度DNA样品的甲基化程度酶的缓冲液性质DNA样品的纯度：蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中dam甲基化酶在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的有BclI、MboI等。大肠杆菌中dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的有EcoRII等哺乳动物中甲基化酶在5’CG3’序列中C5位上引入甲基。酶的缓冲液性质：高浓度酶、高浓度甘油、低离子强度、极端pH值等会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Staractivity现象。如：EcoRI在正常条件下识别并切割5’GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5’AATT3’。DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase）能催化双链DNA片段的5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键，使两末端连接。最常用的DNA连接酶为T4DNA连接酶。用途：连接带匹配粘性末端的DNA分子；使平端的双链DNA分子相互连接；平端的双链DNA分子与合成的寡核苷酸接头（linker）连接。平末端之间连接的效率低。提高平端连接效率的方法加大连接酶用量（10倍于粘端的连接）；加大平末端DNA片段的浓度；加入10%PEG8000；加入单价阳离子（NaCl），终浓度150-200mM。DNA聚合酶E.coliDNA聚合酶I（DNApolI）E.coliDNA聚合酶I大片段（Klenow）T4噬菌体DNA聚合酶（T4DNApol）耐高温DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）用途：缺口前移法，制备32P标记的DNA探针5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’Mg2+5’dNTP5’pppdA（-32P-dATP）5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’DNaseIDNApolIDNApolI特性：具有5’→3’DNA聚合酶活性、5’→3’和3’→5’外切核酸酶活性。nickKlenow酶补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端；DNA片段的同位素末端标记；cDNA第二链的合成；双脱氧末端终止法测定DNA序列。DNApolI经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端2/3的大肽段为Klenow酶。用途：特性：具有5’→3’DNA聚合酶活性、3’→5’外切核酸酶活性，但无5’→3’外切核酸酶活性。补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端：5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRIDNA片段的同位素末端标记：5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’Klenow5’pppdA（-32P-dATP）5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’T4DNA聚合酶在无dNTP时，从3’-OH端外切；在只有1种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在4种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。具有5’→3’DNA聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶活性比Klenow强200倍；特性：用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；DNA片段的同位素末端标记。切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端：5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4DNApol5’…G-C-T-C-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-PHO-C-C-T-C…5’反转录酶特性：具有5’→3’DNA聚合酶活性、5’→3’和3’→5’外切核酸酶活性；以RNA为模板聚合cDNA链；双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。用途：构建cDNA文库；制备同位素标记的cDNA探针。核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII），不需Mg2+；双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），特异性从3’端外切；核酸外切酶（Exo），特异性从5’端外切；单链核酸内切酶：S1核酸酶，内切单链DNA或RNA、带缺口或缺刻的双链DNA；单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶，用于诱发DNA突变。Bal31核酸酶诱发DNA突变：EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化AC核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：碱性磷酸单酯酶（CIP、BAP）：去除DNA5’-P，防止其在重组中自身环化。T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTP。DNA、RNA、dNR、NR5’-OH加磷，用于探针的末端同位素标记。B用于基因克隆的载体质粒噬菌体或病毒DNACos质粒人工染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供条件。载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性（可转移性）；具有合适的筛选标记。具有较高的外源DNA载装能力；具有多种单一的限制性内切酶识别位点；具有与受体细胞相适应的复制或整合位点；特征:自主复制性不相容性可转移性携带特殊的遗传标记1、质粒（plasmid）质粒是某些细菌中独立于染色体之外的、能自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，以共价闭合环状双链形式存在，即cccDNA。严紧复制型：1-3拷贝松弛复制型；10-60拷贝质粒的构建野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求。实验室使用的质粒大多是以少数几个野生型质粒为基础构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr人工构建的质粒分成如下几类：高拷贝质粒