21酶促反应动力学

第二章酶促反应动力学第一节酶催化反应的基本特征•酶是生物提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质是蛋白质。•在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密联系。•生物酶分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较催化剂反应转换数mol/（中心点·S）温度℃酶催化剂菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶碳酸肝酶肽的水解肽的水解肽的水解羰基化合物的可逆反应4×10-3~5×10-18×10-2~1×103×10-3~1×1028×10-1~6×1050~370~370~370~37化学催化剂硅胶－氧化铝硅胶－氧化铝二氧化钒二氧化钒异丙基苯裂解异丙基苯裂解环己烷脱氢环己烷脱氢3×10-82×1047×10-111×1022542025350酶活力表示方法1酶的分子活力：在最适宜条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）2酶的催化中心活力：在单位时间内，每一个酶的催化中心所催化底物的量（mol）3酶活力：在特定条件下，每1min能催化1mol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称为国际单位，用U表示。酶活力还可用比活力表示。比活力系指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。•绝对专一性：一种酶只能催化一种化合物进行一种反应•相对专一性：一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应•反应专一性：一种酶只能催化某化合物在热力学上可能进行的许多反应中的一种反应•底物专一性：一种酶只能催化一种底物•立体专一性：一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种第二节均相的酶促反应动力学1.1.酶促反应的Michaelis-Menten方程1.1.1.酶促反应的Michaelis-Menten方程Michaelis、Menten（1913）提出了单一底物的酶反应模型，基本内容是：酶E的底物S首先形成酶—底物复合物ES，在酶—底物复合物ES的基础上反应生成产物P和酶E。反应式如下：E+SESE+Pk+1k+2k1其中：k+1，k1，k+2——反应速度常数E，S，ES，P——酶，底物，酶-底物复合物，产物根据Michaelis、Menten的单一底物的酶反应模型，其假设条件为：（1）在反应过程中，限制反应速度的反应是ES到E+P这一步反应；（2）E+S到ES的反应在整个过程中始终处于动态平衡；（3）酶以酶游离状态E和酶-底物复合物ES的形式存在，酶在反应过程中总浓度不变；（4）底物浓度比酶-底物络合物浓度要大得多。根据反应的假设条件，可以看出Michaelis、Menten所建立的酶促反应模型式建立在平衡的基础之上的，因而称之为“平衡态理论”。根据假设（1），有单一底物的酶催化反应的反应速度：（1-1）式中：CP，CS——产物，底物的浓度t——时间根据假设（2）有（1-2）ESSPCkdtdCdtdCV2ESSECkCCk11即：（1-3）式中：——酶—底物复合物的解离常数SESmSESECCKCkCkC11mK11kkKm根据假设（3），有：总酶量：（1-4）联立（1-1）、（1-2）、（1-3）、有（1-5）式中：Vmax——最大的酶促反应速度。（1-6）ESEECCC0SmSSmSECKCVCKCCkVmax0202maxECkV1.1.2Briggs-Haldane对M-M方程的修正1925年Briggs和Haldane认为在酶促反应过程中，反应的中间体ES（酶-底物复合物）的浓度不随反应时间而变化，即在酶促反应过程中，反应的中间体ES的浓度处于稳定的状态，基于这一假设所得到的酶促反应的模型称之为“稳定态理论”。即（1-7）0211ESESSEESCkCkCCkdtdC则（1-8）其中（1-9）称作M-M常数SESmSESECCKCCkkkC121121kkkKm代入总酶量（1-4）得（1-10）将（1-10）式代入（1-1）式，有（1-11）ESEECCC0SmSEESCKCCC0SmSSmSECKCVCKCCkVmax021.1.3Michaelis-Menten方程的参数估计对特定的酶促反应，其动力学的M-M方程中的Vmax和Km是该酶促反应的特征参数。对Vmax和Km的确定的方法有Lineweaver-Burk法；Hanes-Woolf法；Eadie-Hofstee法；积分法等（1）Lineweaver-Burk法（简称L-B法）对M-M方程（1-11）式取倒数，得到（1-12）SmCVKVV111maxmax（2）Hanes-Woolf法（简称H-W法）对L-B法的（1-12）式的等式两端同乘CS，此种方法减少了CS值过大或过小所带来的测量误差。（1-13）（3）Eadie-Hofstee法（简称E-H法）将M-M方程重排得到：（1-14）maxmaxVCVKVCSmSSmCVKVVmax（4）积分法用不同的酶促反应的时间t与其反应过程相对应的底物浓度之间的函数关系通过作图或回归的方法确定酶促反应动力学参数。（1-15）SSmmSSSSCCtKVKCCCC0max001ln例：在pH5.1、15℃下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度V0如表所示。求这一酶促反应的动力学参数Vmax和Km。表1-1葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度与底物浓度CS（mmol/L）V0（mmol/L·min）5.550.1638.330.21111.110.24113.890.27616.660.30122.220.33927.770.347解：采用Lineweaver-Burk法，对实验数据回归，有则SCV1100.23981.110min)(mmol/L505.0981.11maxV(mmol/L)661.11505.0100.23mK01234567-0.1-0.0500.050.10.150.21/CS(L/mmol)1/V0(L•min/mmol)-1/Km=-0.0858截距=1/Vmax=1.981斜率=Km/Vmax=23.100采用Hanes-Woolf法，对实验数据回归，有则SSCVC007.2725.22/0min)mmol/L(498.0007.21maxV(mmol/L)323.11498.0725.22mK0102030405060708090-15-55152535CS(mmol/L)CS/V0(1/min)-Km=-11.323斜率=1/Vmax=2.007截距=Km/Vmax=22.725采用Eadie-Hofstee法，对实验数据回归，有则SCVV00583.11503.0L)(mmol/583.11mK)minL(mmol/503.0maxV00.10.20.30.40.50.600.010.020.030.040.05V0/CS(1/min)V0(mmol/Lmin)截距=Vmax=0.503斜率=-Km=-11.5831.1.4酶促反应的反应级数（1）当CS远小于Km时，为一级反应（2）当CS远大于Km时，为零级反应。SmSmSSCKVCKCVdtdCVmaxmaxmaxmaxVCKCVdtdCVSmSS（3）当CS介于上述两者之间时，为0至1级反应00.10.20.30.40.50.60.7050100150200250300CSV零级反应一级反应VmaxVmax/2KmM-M反应1.2有抑制作用的酶促反应动力学1.2.1竞争性抑制的酶促反应动力学当反应物系中存在与底物的结构相似的物质，这一物质也可能与酶的活性部位结合，形成非活性的复合物，阻碍了酶与底物的结合，从而影响酶促反应，这种抑制作用称为竞争性抑制。竞争性抑制的机理为：其中：k+3，k+3—反应速度常数I，EI—抑制剂，酶-抑制剂复合物E+SESE+Pk+1k+2k1E+IEIk+3k3基于稳定态理论，有（1-16）（1-17）总酶量为（1-18）0211ESESSEESCkCkCCkdtdC033EIIEEICkCCkdtdCEIESEECCCC0联立（1-4）、（1-16）、（1-17）、（1-18）式，有（1-19）式中：KmI—竞争性抑制的表观M-M常数KI—抑制剂的解离常数（1-20）SImSSIImSCKCVCKCKCVVmaxmax)1(33kkKICSVVmaxKm有竞争性抑制剂无抑制剂对有竞争性抑制的酶促反应动力学方程（1-19）式取倒数得到（1-21）SmISIImCVKVCKCVKVV111)1(11maxmaxmaxmax000000000001000002000003000004000005000006000007000008000009000010-0.1-0.0500.050.10.150.21/CS(mmol/L)-11/V(mmol/Lh)-1无抑制剂有竞争性抑制剂截距=1/Vmax斜率=KmI/Vmax无抑制剂有竞争性抑制剂截距=1/Vmax斜率=KmI/Vmax无抑制剂有竞争性抑制剂截距=1/Vmax斜率=Km/Vmax斜率=KmI/Vmax1.2.2非竞争性抑制的酶促反应动力学当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑制。与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，无论如何提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。非竞争性抑制的作用机理为：E+SESE+Pk+1k+2k1E+IEIk+3k3EI+SSEIk+4k4ES+ISEIk+5k5其中：k+4，k-4，k+5，k-5，—反应速度常数I，EI—抑制剂，酶-抑制剂复合物IES—底物、酶-抑制剂三元复合物基于稳定态理论，有（1-22）总酶量为（1-23）0dtdCdtdCdtdCSIEEIESIESEIESEECCCCC0有非竞争性抑制的酶促反应动力学方程（1-24）SmSIIISmSCKCVKCCKCVVmaxmax)1)((CSVVmaxKm有非竞争性抑制剂无抑制剂VmaxI024681012-0.1-0.0500.050.10.150.21/CS(mmol/L)-11/V(mmol/Lh)-1无抑制剂有非竞争性抑制剂截距=1/Vmax斜率=Km/Vmax斜率=Km/VmaxI截距=1/VmaxI-1/Km1.2.3反竞争性抑制动力学反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物[Es]相结合生成[SEI]复合物。抑制百分数i:表示抑制剂对酶催化反应的抑制程度。•i值愈大，表示抑制的程度愈大；•i值愈小，抑制程度愈小。•0≤i≤1。1.2.4高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学应用稳态理论，可得到底物抑制的酶促反应动力学方程为（1-25）SISSmSKCCKCVV2maxE+SESE+Pk+1k+2k1ES+SSESk+3k3根据即02maxSISSmSSSKCCKCVdCddCdVSISSISSmKCKCCK21201212mSSISISKCKKC解得：最佳底物浓度：SImoptSKKC,CSVVmax无底物抑制的曲线底物抑制的曲线VoptCS,opt例：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.2×10-1mmol／L的抑制剂，并测其初始的反应速率，其数据见下表。解以L—B作图法来判断抑制类型并求其参数。据此上述实验数据分别取其例数，以l／rSI对1／Cs做图，得到如图所示两条直线，它们在纵轴有一共点交点，这表明该抑制为竞争性抑制。1