百草枯对木质素降解菌产酶及其生物化学变化的影响-生物谷-

生物工程学报ChinJBiotech2009,August25;25(8):1144-11[e-mail]©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:March12,2009;Accepted:June9,2009Correspondingauthor:JianlongLi.Tel:[phone];E-mail:[e-mail],[e-mail]环境生物技术百草枯对木质素降解菌产酶及其生物化学变化的影响赵芸晨1,2,李建龙1,陈育如3,黄海霞1,余醉11南京大学生命科学院国家医药重点实验室,南京2100932河西学院农学系,张掖7340003南京师范大学生命科学学院,南京210046摘要:为研究外源活性氧对木质素降解菌的影响,本实验对外源百草枯诱导下的杂色云芝(Coriolusversicolor)产酶及其生物化学过程进行了研究。将一定浓度的百草枯加入培养7d的杂色云芝菌培养液中,连续培养148h,测定其胞外木质素降解酶、胞内抗氧化酶的活性及生物化学参数的变化。与对照相比,30mol/L的百草枯能够显著促进杂色云芝锰依赖过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)和漆酶(Lac)的活性,3种酶活性分别提高了1.3、7和2.5倍;在连续培养的前48h,30mol/L的百草枯促进了胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性。百草枯对于胞外木质素降解酶活性的促进作用比对胞内抗氧化酶活性的促进作用明显。百草枯的加入促进了胞外酚类化合物与甲醛的浓度的增加,而丙二醛的浓度在培养的前24h内增加,随后下降。结果表明,百草枯的加入对白腐菌产生了氧化胁迫,但菌株的抗氧化系统能够有效地进行氧化剂的清除,从而阻止氧化剂对机体的氧化伤害。百草枯作为外源氧化胁迫剂,可以增加木质素降解酶活性,有利于木质素的降解。关键词:杂色云芝,百草枯,氧化胁迫,木质素降解酶,甲醛ImpactofexogenousparaquatonenzymeexudationandbiochemicalchangesoflignindegradationfungiYunchenZhao1,2,JianlongLi1,YuruChen3,HaixiaHuang1,andZuiYu11StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology,SchoolofLifeScience,NanjingUniversity,Nanjing210093,China2DepartmentofAgronomy,HexiUniversity,Zhangye734000,China3SchoolofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing210046,ChinaAbstract:Tostudytheeffectofexogenousoxygen,weaddedwatersolutionofparaquatto7dculturesofCoriolusversicolorforthenext148h.Enzymeexudationandbiochemiscalprocesswereinvestigatedontheadditionofparaquat.Wefoundthatcomparedwiththecontrol(withoutparaquat),theadditionof30mol/Lparaquatstimulatedtheactivityofmanganesedependentperoxidase(MnP),ligninperoxidase(LiP),andlaccases(Lac)7,2.5and1.3times,respectively.Also,additionofparaquatenhancedactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andcatalase(CAT)inthefirst48h.Impactofparaquatonligninolyticenzymeswassignificantthanthatonantioxidantenzyme.Additionofparaquatenhancedphenoliccompoundsandformaldehydeofculturestoo.Andconcentrationofmalondialdehydewasincreasedinthefirst24h.Theresultsshowedthatadditionofparaquatpromotedoxidativestress,buttheantioxidantsystemsofthefungalstrainaresufficienttopreventmyceliafromoxidativestress.Asexogenousoxygen,paraquatmightbeausefulsubstrateindegradationoflignocellulose.赵芸晨等:百草枯对木质素降解菌产酶及其生物化学变化的影响1145Journals.im.ac.cnKeywords:Coriolusversicolor,paraquat,oxidativestress,ligninolyticenzymes,formaldehyde木质纤维类物质被充分利用生产生物燃料的过程中必须先降解或分离木质素。木质素的降解包括化学、生物、物理或综合处理方式。其中生物预处理具有耗能少、环境条件温和的优点。微生物降解木质素的原理是利用其代谢产生的酶,在常温常压下把复杂的木质素转化为小分子。在木质素的降解菌中,白腐菌是使用最广泛的木质素降解菌。白腐菌能产生完全的木质素降解酶体系,从而解聚和彻底降解木质素[1]。但自然条件下白腐菌产酶量有限,限制了降解的完全程度。因此提高白腐菌分泌木质素降解酶能力,从而更有效地降解木质素对提高木质纤维类物质的利用具有重要的意义。活性氧是好氧微生物进行氧代谢时产生的一类化学性质非常活泼的物质,主要包括超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟自由基等。白腐菌的木质素降解过程与活性氧之间有很大的相关性,活性氧是胞外木质素降解系统中的一种有用的物质[2-3],是木质素降解的启动因子[45]。正常情况下细胞自身活性氧的产生和清除代谢是平衡的,但当活性氧的水平超过细胞的抗氧化能力时,对细胞产生氧化胁迫。活性氧作为一种氧化胁迫因子,同时又参与白腐菌对木质素的降解,因此研究活性氧存在时白腐菌的氧化胁迫反应及相关的木质素降解过程具有非常重要的意义。本实验以百草枯作为外源氧化胁迫剂,以期研究百草枯存在下白腐菌木质素降解酶的产生情况及其生物化学反应,为外源氧化剂与木质素降解之间的相关性提供了一定的理论依据,为木质素的有效降解提供了新的途径。1材料与方法1.1实验菌种杂色云芝009(Coriolusversicolor),购于南京林业大学菌种保藏中心。1.2培养基与培养条件PDA固体培养基:马铃薯浸汁1L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,120oC灭菌20min。PDA液体培养基:马铃薯浸汁1L,葡萄糖20g/L,120oC灭菌20min。发酵培养基:10mmol/L的醋酸缓冲液(pH4.5),内含有葡萄糖2g/L,酒石酸铵12mmol/L,KH2PO41.47×102mol/L,MgSO4·7H2O2.03×103mol/L,CaCl2·2H2O6.8×104mol/L,VB12.97×106mol/L,1g吐温80与7mL微量元素混合液[6],120oC灭菌30min。培养方法:将斜面菌种接种于PDA固体平板培养基,当菌体长满平板时用打孔器打下3~4片9mm2大小的菌片,放入PDA液体培养基,于28oC、150r/min下培养至菌体长满培养基表面,用匀浆器将菌体混匀后以2.5%的接种比例接种于发酵培养基,28oC、150r/min培养7d。氧化胁迫条件:百草枯添加浓度通过实验由漆酶活性大小进行确定。本实验所用百草枯的终浓度为30mol/L,于实验开始前准备百草枯水溶液,直接加入液体培养基,继续培养148h,培养条件同上。1.3测定液的准备所有测定在加入百草枯24、48、72、120、148h时进行。测定前取一定体积混匀的菌体培养物,将混匀物在4000r/min下离心10min,上清液用于胞外木质素降解酶(锰依赖过氧化物酶、木质素过氧化物酶、漆酶),以及低分子物质(甲醛、丙二醛、超氧阴离子、酚类化合物)的测定。用蒸馏水清洗离心后的菌体沉淀物,再将菌体沉入冷(3oC~4oC)1146ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechAugust25,2009Vol.25No.8Journals.im.ac.cn磷酸缓冲液(50mmol/L,pH7.4)。再用匀浆器在冰浴中保持4oC~6oC将细胞打破,破碎细胞于4oC10000r/min下离心10min,收集上清液用于胞内抗氧化酶的测定。1.4酶活性测定方法1.4.1木质素降解酶活性测定漆酶(Lac)活性测定采用Arora法[7],测定过程稍有改动。反应液中包含3.8mL琥珀酸缓冲液、1mL愈创木酚、0.2mL酶提取液,反应完成后于450nm处测定分光光度值的变化。木质素过氧化物酶活性(LiP)的测定采用Tien法[8],也进行了一定的改进,反应液中加入0.1mLH2O2启动反应,310nm测定分光光度值的改变量;锰过氧化物酶(MnP)活性测定采用Wariishi法[9],反应用终浓度为0.1mmol/L的H2O2启动。酶活性的表示方法采用比活力表示为U/mg蛋白。1.4.2抗氧化酶活性的测定超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用Marklund法[10],测定结果以对焦酚自氧化抑制的百分率表示(1U=50%的抑制率)。过氧化氢酶(CAT)活性测定采用Aebi法[11],酶活性的表示方法采用比活力表示为U/mg蛋白。1.5小分子代谢物质的测定甲醛浓度的测定:采用钠氏试剂分光光度法在410nm下进行测定[12],测定结果代入标准曲线计算(y=0.0457x0.0039,R2=0.999)。酚化合物的测定:采用磺铵DASA检测法,500nm下测定吸光度的变化[13],测定结果代入标准曲线计算(y=6.35x0.0213,R2=0.997)。超氧阴离子的测定:采用菌体超氧阴离子产生的快速测定法,560nm下测定吸收值的变化(对照每毫升中含有40L/mg的商用SOD酶)[14]。丙二醛含量的测定:采用TBA法,分光光度计检测TBA的产生量[15],并消除影响因子值。1.6蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法,以牛血清为标准品[16]。2结果2.1百草枯对菌体蛋白含量的影响外源百草枯加入后,随着培养时间的增加,对照的菌体蛋白先下降后上升,而百草枯处理菌体蛋白含量呈现先下降后上升又下降的趋势(表1)。2.2百草枯对木质素降解酶活性的影响外源百草枯的加入引起了胞外木质素降解酶活性的显著变化。Lac活性较对照显著增加,最高的漆酶活性出现在百草枯加入后120h,为7U/mg蛋白(图1),除Lac活性增加外,MnP与LiP的活性也显著增加(图2、图3)。最高的MnP活性在百草枯加入后48h(约23U/mg蛋白),为对照样品MnP活性的7倍左右。最高的LiP活性出现于百草枯加入后48h(约51U/mg蛋白),为对照样品LiP活性的2.5倍。表1不同处理时间菌体蛋白的含量Table1Proteinofmyceliaindifferenttreatmenttimet(h)Proteinofmycelia(mg/mL)02448