硒的形态分析方法概述及其在生物有效性研究中的应用

硒的形态分析方法概述及其在生物有效性研究中的应用摘要：硒的形态研究是了解环境中硒的毒性、生物可利用性、迁移和生物地球化学循环等方面的基础。本文总结了环境样品中硒形态的研究方法，及其形态分析在生物有效性研究中的应用。关键词：硒；形态分析；方法；生物有效性；应用1前言硒位于第六主族,是一种准金属元素。地壳中硒的丰度仅为0.05-0.09µg/g,但由于人为因素与自然因素的影响使硒在自然界中分布日益广泛,一般大气、水、土壤中硒水平为µg/g-ng/g级。一定条件下,各种形态的硒类化合物可相互转化。有报道以葡萄糖作为外加碳源,研究天然水体中亚硒酸钠通过微生物反应转化为单质硒和挥发态硒(如二甲基硒、二甲基二硒)的实验。1957年，Schwar首先证明硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心,是人体必需的微量元素。近年来,适量的硒摄入水平与癌症、心血管病、糖尿病、白内障、老年痴呆症等各种疾病的密切相关性日益引起人们的重视。我们在贫硒地区通过口服亚硒酸钠来治疗预防克山病、大骨节病。硒作为多种重金属元素(如Cd、Hg等)的天然解毒剂、可拮抗环境中多种有害物质的毒性。硒化合物的生理、生物活性，及其在环境中的迁移转化规律，同硒存在的化学形态及不同化学形态下硒的浓度水平直接相关。硒分析方法在研究生命科学、环境科学、材料科学等领域均具重要意义。1环境中硒的存在形式硒存在形式的早期研究主要集中于矿床学、矿物学和环境地球化学。朱建明等[1]于2003年对已发现的107种硒矿物进行了总结和归类，概述了表生环境中硒的存在形式。环境中硒主要以无机和有机硒形式存在(表1)[2-4,5]，不同硒形态间会因pH、Eh和生物作用(如甲基化)等因素的影响而发生转变，其中pH-Eh是主要的影响因素。图1给出了常温常压下不同形态硒稳定存在的pH-Eh范围。表一环境中主要的硒化合物[2,5]Table1Themajorseleniumcompoundsintheenvironment硒化合物化学式存在条件无机硒硒化氢(-Ⅱa)H2Seb气体，不稳定，水中易分解成Se0硒氢化物(-Ⅱ)Se2-还原环境，金属硒化物，土壤中元素硒(0)Se0还原环境稳定存在，水中不溶解亚硒酸盐(Ⅳ)SeO32-弱氧化条件，易溶解，如土壤或大气颗粒偏亚硒酸盐(Ⅳ)HSeO32-酸性或中性条件，易还原，如土壤中二氧化硒(Ⅳ)SeO2化石燃料燃烧放出的气体，易溶于水硒酸盐(Ⅵ)SeO42-弱氧化条件，易还原，易为植物利用硒酸根(Ⅵ)SeO42-，HSeO4-一般土壤环境有机硒二甲基硒化物(DMSe)(CH3)2Seb土壤中微生物、细菌形成的挥发组分二甲基二硒化物(DMDSe)(CH3)2Se2b植物形成的挥发组分二甲基硒砜(CH3)2SeO2bDMSe的前期还原挥发产物，由代谢形成三甲基硒(CH3)3Se+动物代谢产物，以尿形式排放注：a表示无机硒化合物中硒的价态；b表示该硒化合物具有挥发性。此外，生物体内还有硒代半胱氨酸(Selenocysteine)、硒代胱氨酸(Selenocystine)、硒代蛋氨酸(Selenomethionine)、硒乙硫基氨基酪酸(Selenothionine)、硒甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine)、硒甲基硒代蛋氨酸(Se-methylselenomethionine)、γ-谷氨酰硒甲基硒代半胱氨酸(γ-glutamyl-Se-methylselenocysteine)、硒蛋白(Selenoprotein)等有机硒化合物[5,6]，对它们的分离和定量分析一般要用仪器联用技术。图1常温常压下硒的pH-Eh图[7]Fig.1Eh-pHdiagramofseleniumspeciesat25℃，1atm，and∑Se=10-6M2总硒测定2.1分子荧光分析法和吸光光度法现行中华人民共和国标准中采用2,3-二氨基萘荧光法[8]。原理是利用四价硒与DAN(2,3-二氨基萘)反应生成强荧光特性的4,5-苯并苤脑，用有机溶剂萃取后在荧光分光光度计上于激发波长366nm、发射光波长520nm处测定荧光强度。此法选择性好、灵敏度高，但操作繁琐费时且试剂需进口且对人体有害。王守兰等[9]用该法测定富硒米、富硒茶中痕量硒，检出限为1ng。常规荧光法测定硒时，存在485nm杂质荧光峰与519.2nm检测荧光峰相重叠，干扰了硒的测定，使结果偏高。胡益水[10]采用一阶导数荧光法测定茶叶中的硒，有效地消除干扰，改善了灵敏度和检测限。紫外及可见分光光度法为硒的常用分析方法，常用试剂有环戊酮、硫代乙醇酸苯肼、二氨柯嗪、邻苯二胺等、以及3,3-二氨基联苯(DAB)和2,3-二氨基萘(DAN)应用最为广泛[11-13]。杨明敏等[14]在0.5mol/L盐酸介质中用巯基棉富集水中硒(Ⅳ)，解吸后用一种新的萃取分光光度法测定，本法基于硒(Ⅳ)将碘离子氧化成碘络离子，碘络离子和结晶紫分子形成的配合物被二甲苯萃取，检测下限可达0.5μg/L。此外，催化光度法也常用于食品中痕量硒的分析。郝素娥[15]应用催化光度法测定了硒酵母中有机硒的含量，测定原理是四价硒能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合生成的红色偶氮染料的吸光度在一定范围内与硒成正比。刘长久[16]利用阻抑氧化甲基橙动力学光度法测定四价硒，研究了反应的最佳条件及动力学参数，建立了动力学光度法测定痕量硒的新方法。寻找高灵敏度的显色试剂和建立高灵敏的显色体系依然是光度法今后的研究方向。2.2原子光谱法原子吸收光谱法是基于物质所产生的原子蒸汽对特定谱线的吸收作用来进行定量分析的一种方法。石墨炉原子吸收光谱法存在硒的挥发损失、干扰等问题。张奇等[17]在用石墨炉原子吸收法测定样品中硒时采用不同的基体改进剂均获得较好的效果。王宏[18]采用石墨炉平台技术和塞曼扣背景系统消除基体干扰，并用铜基体改进剂，测定了鸡蛋中微量硒，也获得满意结果。氢化物石墨炉原子吸收光谱法是近年来发展起来的一项技术。它使测定元素转化成气态氢化物与基体分离，受干扰较小、灵敏度高、重现性好。马玉平[19]将流动注射技术与之结合，克服了间歇式氢化物发生器操作复杂，测定速度慢的缺点，使该法的实用价值得到提高。样品不经分离，直接进样测定。刘波静等[20]用氢化物原子吸收法测定螺旋藻中痕量硒，结果令人满意。该方法下限可达17ng/g，样品回收率为98.89%-101.20%。氢化物原子荧光光谱法[21]原理是将样品中硒转化为Se(Ⅳ)，用NaBH4或KBH4作还原剂，将Se(Ⅳ)在HCl介质中还原成SeH4，由载气带入原子化器中进行原子化，在硒特制空心阴极灯照射下，基态硒原子被激发至高能态，在去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光，其荧光强度与硒含量成正比。氢化物原子荧光光谱法，测定食品中硒准确度高、灵敏度、精密度好，线性范围宽，所用试剂毒性小，实用性强，已列入国标法。在任何高温气体中，如有1%以上原子或分子被电离，该气体即具有相当大的电导率，这种自由电子、离子和中性原子或分子组成的中性气体，即称为等离子体[20]。HG-ICP-AES已广泛应用于啤酒、蜂蜜、猪肉中痕量硒的分析[22]。在天然药物中该法也常被使用。2.3电化学法测定硒的电化学法有电位滴定法、溶出伏安法、催化极谱法、离子选择电极法等，应用较多的是溶出伏安法和催化极谱法，具有仪器简单、灵敏度高、应用范围广等特点。葛宣宇[23]自制的玻碳金膜电极采用微分电位溶出伏安法测定了矿泉水中的硒，最低检出限0.5μg/L。汪振辉等[24]用Nafion修饰金膜玻碳电极溶出伏安法测定痕量硒，解决了非汞电极测定硒时重现性差的问题，同时改善了灵敏度和选择性。硒在很多底液中都能产生良好的极谱波，但以Na2SO3-NH4Cl-HClO4-KIO3底液法测定硒灵敏度最高。汪模辉[25]用催化极谱法测定茶叶和大麻笋中的痕量硒，采用二阶导数法测定，线性范围为0-50ng/25ml，检出限为1.44ng/25ml。极谱法存在的缺点是电极易被污染，电活性物质有毒性。2.4其它分析方法气相色谱法(GC)测定四价硒有很高的灵敏度和可靠性。原理是利用邻苯二胺及其衍生物选择性地与四价硒生成苯并硒二唑，通过色谱法分离，用电子捕获器进行检测。靳利娥[26]将枸杞用密封消化罐分解消化，加入KBH4将其中的硒转化为氢化物，用液氮冷阱捕集、浓缩，通过GDX-104色谱柱进行分离，检出限为8.6×10-11g，分析了大同、太原、运城和忻洲四地所产枸杞中硒的含量。高效液相色谱法(HPLC)与GC原理相似，使用的是荧光检测器。离子色谱配以电导检测器多用于样品中硒的形态分析。中子活化技术测定硒具有快速、准确、灵敏度高且能同时分析许多元素等优点，但一般实验室不具备该实验仪器设备，还未得到广泛应用。使用电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)测定硒灵敏度高，但基体干扰严重，适当的前处理有助于清除干扰，改进进样技术也可使检测限进一步降低。3形态分析食品中的硒多以硒蛋白和硒代氨基酸等有机态存在。目前，测定有机硒的方法大多是测其总量-先测定无机硒(Ⅳ)含量，再测总硒含量，两者差值即为有机硒的含量，对其中硒的形态研究较少。然而食品中硒的形态不同，在人体内代谢途径不同，产生的功效也不同，因此，分析硒的形态也十分必要。3.1硒蛋白的分离纯化硒蛋白的分离纯化方法有盐析法、离子交换法、薄层色谱、凝胶色谱、气相色谱及电泳法等。吴永尧等[27]用(NH4)2SO4分段盐析，分子筛柱层析，分离出水稻中硒蛋白组分。聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对蛋白质分子量的确定有很好的精确性，而且样品的预处理简单，适合对未知蛋白质的分离和测定。谢申猛等[28]采用凝胶电泳技术分离恩施高硒地区大豆中含硒蛋白组分，分辨出27条蛋白条带，用高效液相色谱荧光法对这些条带分别进行硒含量测定，发现13条硒蛋白，用标准分子量蛋白标定含硒蛋白组分的分子量。3.2硒蛋白及氨基酸的检测普遍认为，在谷物、大豆和硒酵母中硒主要以硒代蛋氨酸形式存在，而动物组织中硒主要以硒代半胱氨酸存在，约占总量的50%以上。郝素娥等[15]用透析法使硒酵母中有机硒和无机硒分离，再用氨基酸分析仪测定了硒酵母中硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，采用低速长柱，与其它氨基酸的分离度达90%以上。农晋琦等[29]将硒半胱氨酸甲基化，硒胱氨酸还原后再甲基化生成甲基硒半胱氨酸与溴化氰发生专一性反应生成硒氰酸甲酯，再用气相色谱法测定了硒酵母和硒蛋白中的硒氨基酸。随着现代分析仪器的发展，各种联用技术的使用使硒的形态分析更加广泛和深入。吴永尧等[27]将硒蛋白经酸水解后采用标准样对照法用高效液相色谱分离，检出硒代氨基酸，再用质谱法进一步确定其形态。李方实[30]提出了一种高效液相色谱分离和ICP-MS或FAAS作为元素专一检测器在线测定硒的化学形态方法，用ESAⅢ阳离子色谱柱以柠檬酸铵为流动相，分离测定三甲基硒离子、硒代蛋氨酸、亚硒酸和硒酸盐。各种联用技术中HPLC-ICP-MS和CE-ICP-M灵敏度较高。文献[31,32]用RP-HPLC-ICP-MS分析海鸥蛋中的有机硒化合物，分析出6种硒化合物，其中两种用标准加入法确证为硒半胱氨酸和硒胱氨酸。HPLC-ICP-MS和CE-ICP-MS联用技术进行形态分析常需同标准物质对照完成，尽管可灵敏提供样品分离后相应元素测量信息，但不能给出对应的结构组成，电喷雾质谱技术ESI-MS与HPLC、CE等分离手段联用可完全地分析溶液中存在的金属类生物大分子化合物的化学键结构与金属结合或螯合的特定蛋白质、氨基酸分子的结构，但其灵敏度较低。今后，在提高硒检测方法灵敏度和准确度的同时，要发展对硒的各种形态分离富集技术和高灵敏度、高选择性的分析方法。4形态分析在研究微量元素生物有效性中的应用食品中微量元素的形态分析不能停留在静态检测，而应该将该技术应用到如何提高微量元素的生物有效性和开发功能食品的研究上。微量元素在人体和其他生物体内的代谢过程和生物活性的研究与功能食品的开发具有密切的关系，前者可以为功能食品的研究开发提