硕士论文-灌注型生物活化骨修复节段性骨缺损的实验研究

第四军医大学硕士学位论文灌注型生物活化骨修复节段性骨缺损的实验研究姓名：王超锋申请学位级别：硕士专业：外科学（骨外）指导教师：王臻20070501第四军医大学硕士学位论文1缩略语表缩略语英文全称中文全称β-TCPβ-tricalciumphosphateβ-磷酸三钙BMSCbonemarrowmesenchymalstemcells骨髓基质干细胞DiI1，1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetr碳化青荧光染料amethylindocarbocyanineperchlorateMSCsmesenchymalstemcells基质干细胞ABGautogenicbonegraft自体骨移植BMPbonemorphogeneticprotein骨形态发生蛋白ADSCsadiposederivedstemcells脂肪源性干细胞ESCembryonicstemcell胚胎干细胞PDGFplatelet-derivedgrowthfactor血小板衍生生长因子IGFinsulin-likegrowthfactor胰岛素样生长因子VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子FGFfibroblastgrowthfactor成纤维细胞生长因子PLApolylacticacid聚乳酸PGApolyglycolicacid聚乙醇酸PLGAPoly(lactide-co-glycolide)聚（乳酸／羟基乙酸）共聚物BMDbonemineraldensity骨密度TMDtissuemineraldensity组织密度DMEMDulbeco’smodifiedeaglemedium改良的MEM培养液PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液第四军医大学硕士学位论文3灌注型生物活化骨修复节段性骨缺损的实验研究硕士研究生：王超锋导师：王臻教授（主任医师)第四军医大学西京医院骨科，西安710032中文摘要创伤及肿瘤所致的节段性骨缺损一直是骨科医生面临的难题之一。目前治疗节段性骨缺损的方法多种多样，既有自体骨移植、异体骨移植、人工关节置换等传统技术，又有尚未在临床上广泛应用的新型生物材料修复技术，然而各种移植方法、技术都存在目前尚未能很好解决的缺点，致使临床治疗中，骨科医生就治疗方法、技术难以达成共识，影响患者治疗及骨科医生之间的交流。近年来随着材料科学的发展及骨组织工程技术的进步，人工骨的研究越来越受到骨科工作者及材料专家的青睐。研发具有优良性能的新型支架材料和探寻组织工程骨培养的新方法是目前组织工程骨研究领域的两大热点。本实验选取新工艺生产的可控性微结构多孔磷酸三钙生物陶瓷（β-TCP）为支架材料，以自体骨髓基质干细胞（BMSC)为种子细胞，探寻一种观察不透光支架材料上活细胞增殖的方法，并利用灌注培养法体外构建生物活性组织工程骨、植入山羊节段性胫骨缺损处，研究体外活化组织工程骨的可行性及其修复节段性骨缺损的能力。一、DiI荧光标记的骨髓基质干细胞与支架材料复合后观察的研究目的通过DiI荧光标记后的骨髓基质干细胞（BMSC）与β-磷酸三钙（β-TCP）支架复合后的镜下观察，找到一种大块支架材料上活细胞观察的新方法。为组织工程骨的研究提供新的可行性方法。方法取山羊的第3代BMSC消化后分为实验组和对照组，实验组DiI标记，另一组为不标记的正常细胞，第四军医大学硕士学位论文4测定生长曲线。另以相同数量两组细胞同β-TCP材料复合后培养，测定两组细胞贴附率，在第3、7、14天时，测其在β-TCP材料上的增殖情况，并在荧光显微镜下连续观察标记后的BMSC的生长状况。结果实验组和对照组的生长曲线基本吻合，两组之间各时间点的细胞计数都没有统计学意义（P0.05）。两组细胞与β-TCP材料复合三维共培养后，第3、7、14天细胞增值率未见显著性差异（P0.05）。荧光显微镜观察染色后的BMSC细胞可见细胞胞膜发出红色荧光呈环状，胞核未着色，显现良好。结论DiI荧光标记后的BMSC生长增殖，可在荧光显微镜下活体连续观察，在大段不透明支架材料上的细胞观察能作为一种较好的新方法来研究种子细胞与支架材料的相互作用，可以成为组织工程骨研究中的新观察方法推广应用。二、组织工程活化骨体外动态灌注培养的研究目的研究灌注培养法体外构建长节段组织工程活化骨的可行性。方法利用灌注型生物反应器对复合骨髓基质干细胞的大段磷酸三钙柱状载体进行动态灌注培养(动态培养组)2周或传统静态培养(静态培养组)2周,通过葡萄糖日耗量、细胞活力(MTT比色法)检测以及硬组织切片观察等方法，检测BMSC在载体内的扩增情况。结果葡萄糖的日消耗量随培养时间的延长而增加，培养前10天较后4天增加更迅速，动态培养组的葡萄糖日耗量明显大于静态培养组。动态培养组的细胞活力明显高于静态培养组。在动态灌注培养下，骨髓基质干细胞能够在大段载体中心及周缘存活并增殖，而在静态培养下，骨髓基质干细胞仅能在载体周缘存活增殖，细胞数量明显少于动态培养组。结论灌注型生物反应器使骨髓基质干细胞在大段三维载体内存活并增殖，且分布均匀，提高了细胞在载体内的复合效率，是一种可行的组织工程骨体外活化方法。三、组织工程活化骨修复山羊节段性骨缺损的实验研究第四军医大学硕士学位论文5目的探讨以多孔β-磷酸三钙生物陶瓷(β-tricalciumphosphate,β-TCP)与自体骨髓间充质干细胞(autologousbonemarrowmesenchymalstemcells,BMSC)体外动态灌注培养的生物活化组织工程骨修复节段性骨缺损的效果。方法体外培养山羊BMSC，利用自制生物反应器将自体BMSC与多孔β-TCP体外培养，分为动态灌注培养、静态培养两组，两组均体外培养两周后，植入山羊左、右胫骨中段人工造模的30mm长的骨缺损处，实验组植入动态灌注培养组织工程骨；对照组植入静态培养组织工程骨。术后及饲养期间缺损区定期行放射学分析，术后24周处死动物行组织学、Micro-CT等成骨性检测。结果X线分析显示实验组成骨优于对照组，硬组织切片VanGieson染色分析可见实验组明显多于对照组，Micro－CT分析可见实验组BMD、TMD均较对照组不同，明显为骨转换后的结果（均可见p0.05）。结论利用自制组织工程骨体外生物活化器将β-TCP与自体BMSC体外动态灌注培养的组织工程骨在成骨性能、成骨量、骨缺损的修复方面均较传统静态培养的组织工程骨明显提高。由此可见体外灌注培养生物活性骨技术是一种可用于临床治疗骨缺损的新技术。关键词组织工程骨；灌注培养；骨髓基质干细胞；长节段骨缺损；DiI；β-磷酸三钙第四军医大学硕士学位论文7ThestudyoftissueengineeringboneculturedbyperfusionforrepairofsegmentalbonedefectsCandidateformaster:WANGChaofengSupervisor:WANGZhenOrthopaedicsinstitute,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaAbstractSegmentalbonedefectsresultingfromtrauma、excisionofbonetumororpathologyrepresentacommonandsignificantclinicalproblem.Limbamputationwashistoricallytheprincipaltreatmentoptionforthesedefectsastheytypicallydonothealspontaneously.Withadvancesinmedicineandscience,alternativetreatmentoptionshavedevelopedsuchastheuseofbone-graftingtechniquesincludingautologous、allogeneicandtissueengineeringbone.Autologousbonegraftsarepreferredastheypossessinherentosteoconductivity,osteogenicityandosteoinductivity.However,thereisoftenlimitedsupplyofsuitableboneforautologousgrafting,anditscollectionisfrequentlyassociatedwithdonor-sitemorbidity.Aontheralternativeistouseallogeneicbonegraftsfromdonorsorcadavers.Thesecircumventsomeofthelimitationsassociatedwithharvestingautologousgrafts,butallogeneicbonegraftslackosteogenicity,havelimitedosteoinductivityandpresentariskofdiseasetransmission.Theselimitationsnecessitatethepursuitofalternativesforthemanagementofsegmentalbonedefects,withthelatestapproachbeingtousetissue-engineeringtechniques.Atpresent,thefeasibilityofsegmentalbonedefectsrepairedbythescaffolds第四军医大学硕士学位论文8combinedwithBMSCarebeingstudiedinsomeinstitution.Inthecurrentpaper,wefindoutanovelmethodofinvestigatinglivelycellsongreatscaffoldmaterial,throughobservingthecombinationofBMSClabeledbyDiIandβ-TCPscaffold;Andwepresentatissue-engineeringstrategyforthecultureoftissueengineeringbonebyperfusionculturebioreactordesignedbyourselves.β-TCPscaffoldscombinedwithauto-BMSCwereculturedbyperfusionculturebioreactor，andimplantedinto30mm-sizeddefectsinanestablishedgoatmodel.Defectsandscaffoldswerestabilizedwithaload-sharingdevice(forcingplate).Theaimwastoinvestigatetheeffectoftissueengineeringboneculturedbydynamicperfusiononsegmentaldefectrepairinthegoattibia.1.ObservationOfTheDiILabeledBoneMesenchymalStemCellsCombinedWithTheGreatScaffoldbyFluorescentMicroscopeObjectiveTofindoutanovelmethodofinvestigatinglivelycellsongreatscaffoldmaterial,throughobservingthecombinationofBMSClabeledbyDiIandβ-