神经生物学的形态学研究方法

第一部分神经生物学的形态学研究方法一、研究神经细胞的形态及细胞构筑的方法（一）尼氏（Nissl）染色法原理用碱性染料染神经组织常用染料焦油紫、硫堇、中性红结果尼氏小体被染色，背景无色。用途皮质的分层、分区、脊髓灰质的分层、核团的分区、细胞的构筑（二）高尔基（Golgi）镀银染色法原理铬银与脂蛋白形成复合物，在细胞膜系统的间隙内形成结晶结果整个细胞为黑色用途显示整个细胞的全貌二、研究神经径路的方法（一）溃变法原理神经元胞体或纤维损伤后远侧部分发生顺行变性（纤维交替膨胀和狭窄，呈念珠状继而呈颗粒状），可用镀银法显示或电镜观察。胞体发生逆行变性（胞体内色质溶解，胞体肿胀，核偏向胞体的一边），可用尼氏法显示。应用研究纤维联系。（二）辣根过氧化物酶（HRP）标记法原理HRP注入神经组织或脏器—逆行、顺行、过节标记—H2O2、色原酶反应—呈色试剂HRP：1.游离HRP2.结合HRP(WGA-HRP、CT-HRP）色原：1.二氨基联苯胺(DAB)2.二盐酸联苯胺(BDHC)3.邻-联茴香胺(OD)4.四甲基联苯胺(TMB)稳定剂:硝普钠、钨酸钠用途研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。（三）荧光素轴突逆行传递标记法原理将荧光物质注射至神经元的轴突分布区,经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜下可看到胞体内呈现荧光标记物。荧光素FurogoldFB-NYGB-NYTB-BbPI-BbEB-DAPA应用研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。（四）放射自显影示踪技术原理将放射性同位素3H等标记的氨基酸导入神经组织，氨基酸被神经元摄取后在胞体内合成蛋白质，沿轴突顺行运输，分布于整轴突和末梢，同位素产生的核射线使照相乳胶感光，根据感光银粒所在部位和黑度判断放射性示踪剂的位置和数量，从而确定神经纤维的路径。示踪剂3H-脯氨酸标记终末、跨突触标记3H-亮氨酸标记终末、纤维3H-HRP酶蛋白与HRP结合双标记用途研究神经元的传出路径（五）2-脱氧葡萄糖放射自显影法原理2-DG能与葡萄糖竞争和6-磷酸葡萄糖异构酶结合，但不能转化为相应的磷酸果糖，因此滞留在细胞中。将2-DG标记上放射性同位素，就可追踪中枢神经系统中各种神经结构的代谢率。结果在感光底片上，代谢率较高的核团和区域银粒较密。用途显示处于兴奋状态的神经元链。（六）植物凝集素标记法原理凝集素通过神经细胞膜上不同受体的介导而被胞饮入神经元内，经轴突运输至一定部位，再用免疫组化的方法显示。凝集素麦芽凝集素（WGA）可与HRP、荧光素结合菜豆凝集素（PHA-L）用途顺行或逆行追踪，研究神经通路。（七）葡聚糖胺结合生物素原理葡聚糖胺结合生物素(BDA)被胞饮入神经元内，经轴突运输至一定部位，再用组化反应或荧光显微镜显示。用途顺行追踪，研究神经通路。（八）病毒标记法原理活病毒导入神经元，增殖，顺次进入各级神经元，用免疫组织化学显示。病毒疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ⅰ型、猪疱疹病毒）弹状病毒用途跨突触标记（顺向或逆向）近年来，用分子生物学方法制作基因重组病毒。将绿色荧光蛋白（GFP）的基因整合入病毒，通过病毒增值，GFP在感染的神经元中表达。在荧光显微镜下观察GFP基因重组病毒在单个神经元范围内顺行或逆行标记，可显示神经元全貌，与Golgi法相似。三、研究神经肽分布的方法（一）黄递酶组织化学原理尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶（NADPH-d）是神经型一氧化氮合成酶(nNOS)的辅酶，两者高度共存。可将底物B-NADPH氧化成B-NADP，释放H2，使显色试剂硝基四氮唑蓝(NBT）还原成DBT,黄色变成蓝色或紫蓝色。用途研究周围及中枢神经系统nNOS神经元。（二）诱发荧光组织化学法原理神经元内含量很微的单胺类物质如多巴胺（DB）、去甲肾上腺素（NA）、肾上腺素（A）和5-羟色胺（5-HT）与某些醛类物质在一定条件下发生聚合反应，形成新的环形化合物，在荧光显微镜下发出较强的不同颜色的荧光。醛类乙醛酸、多聚甲醛加戊二醛等用途研究周围及中枢神经系统单胺类神经元。（二）免疫细胞化学方法原理用特异抗体加在神经组织切片上孵育，形成抗原-抗体复合物，将之用可见物质（荧光素、HRP、同位素等）标记出来，在镜下观察。分类直接法间接法直接法标记抗体——抗原——显微镜观察特点：简单、省时、特异性高、非特异性染色轻。敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。现少用。间接法标记抗抗体抗体抗原显微镜观察特点：只要标记一种抗体就可检测多种抗体。敏感性高，用途较广。目前多用。非标记抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶法（抗酶抗体、PAP法）原理酶抗体（兔）——二抗（羊）——一抗（兔）——抗原抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）原理生物素即维生素H，它与卵白素有极高的亲合力；生物素与抗体或多种酶结合后，抗体及酶的活性不受影响。ABC复合物——生物素化二抗（羊）——一抗（兔）——抗原ABC复合物：HRP-生物素-卵白素卵白素酶生物素待测抗原生物素化二抗（羊）一抗（兔）ABC复合物待测抗原一抗二抗PAP复合物免疫荧光标记原理通过生物素将荧光标记物(如FITC\TexRed)直接与2抗结合。抗原——一抗（兔）——结合荧光素的二抗（羊）ABC法染色原理免疫荧光双标记免疫胶体金技术胶体金（金的水溶液）能稳定而迅速地吸附蛋白，而蛋白的生物活性没有明显改变。免疫金探针（胶体金+免疫球蛋白）进行细胞表面和细胞内多糖、糖蛋白、蛋白质、抗原及激素等大分子的精确定位。主要以电镜观察。免疫细胞化学技术小结放射免疫组织化学用同位素标记抗体免疫荧光组织化学用荧光素标记抗体免疫酶组织化学用酶标记抗体免疫胶体金组织化学用金标记抗体非标记免疫酶组化（PAP法）用免疫方法制备酶抗体亲和免疫细胞化学（ABC法）酶标生物素与卵白素结合生物素化抗体人人兔抗人羊羊抗兔结合TexRed小鼠抗人羊抗小鼠结合FITC四、电子显微镜技术（透射电镜）应用：用于研究神经组织的超微结构。具体应用于：研究正常神经组织的超微结构研究神经组织的发育、衰老变化研究神经纤维联系与HRP、溃变等结合研究神经肽的分布与免疫组化结合多项研究的结合五、原位分子杂交组织化学技术核酸分子杂交技术：在碱性环境下，加热或加入变性剂，使双链DNA分子解链成两条单链（或单链RNA），加入已知的标记RNA或DNA序列片断（探针），在一定条件下，则DNA与相应的互补DNA或RNA、RNA与相应的RNA重新形成稳定的异质双链分子（DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA、RNA-DNA）。上述形成异质双链的过程称分子杂交。核酸分子杂交依据杂交条件不同分三种类型：液相杂交、固相杂交、原位杂交原位分子杂交组织化学：核酸分子杂交技术与组织细胞化学及免疫组织化学技术结合起来，在组织细胞原位显示某种特定基因、mRNA及其产物（特异蛋白）的表达、定位、半定量及其变化规律的技术。应用显示脑内各种mRNA的分布特点。观察发育过程中基因表达的发生、发展规律。研究基因表达的影响因素及其调节机制。研究人类神经系统疾病。脑内特定的mRNA的半定量观察。与其它形态学方法结合应用。免疫组织化学与原位杂交组织化学技术的比较IHCISHH原理抗原抗体反应碱基互补显示结构特定的抗原特定的mRNA、基因（mRNA编码的蛋白质）（特定的基因部位）显示部位最终产物的部位蛋白质合成的部位（胞体及突起、终末）（胞体）六、其它新技术（略）第二部分边缘系统在神经系统发生过程中，由古皮层和旧皮层演变而来的哺乳动物大脑的古老结构被称为边缘系统。许多学者认为它还应包括神经系统中与这些结构有密切关系的区域，故边缘系统所包含的神经部位相当广泛。已有研究工作证明边缘系统和呼吸、循环、内分泌、摄食饮水、体温调节和性行为等生理功能有关；另一方面，这个系统和许多高级机能活动，如学习、记忆、睡眠和情绪活动有着密切的关系。所以边缘系统越来越为研究工作者所注意。边缘系统包括边缘叶和皮质下结构。一、前脑边缘叶（皮质部分）前脑边缘叶limbiclobe即边缘系统的皮质部，位于半球内面邻近脑干处，由内外两圈组成。内、外圈以胼胝体沟、海马沟为界。此外，脑岛前部、眶回后内侧部等也列入边缘叶的范围。外圈：扣带回、扣带回峡、海马旁回及钩，合称穹窿回。内圈：海马结构和梨状叶的近中线部分。（一）海马结构1．胼胝体下回subcallosalgyrus即终板旁回，位于终板和后旁嗅沟之间，向上连灰被，向下连斜带回和内侧嗅纹。2．灰被indusiumgriseum即胼胝体上回，是被盖于胼胝体背面的一薄层灰质，向外移行于扣带回皮质。灰被背面有内侧纵纹和外侧纵纹。灰被向后延续为束状回。3．海马和齿状回海马hippocampus又称安蒙氏角cornuammonis，位于侧脑室下角底部，表面有室管膜，膜的深面一层白质为室床，其纤维向后聚集形成海马伞。齿状回dentategyrus为狭长的皮质带，位于海马的内侧，除内侧面外均为海马包绕，其内侧面位于海马沟和海马伞之间。4．下托subiculum是海马旁回皮质和海马皮质的过渡区。根据细胞构筑，下托可分为四条带：下托尖（副下托）、下托、前下托和旁下托。一般把前二者归入海马，后二者归入内嗅区。（二）梨状叶梨状叶piriformarea包括外侧嗅回、钩（部分）、海马旁回前部。梨状叶可分三区：前梨状区——为外侧嗅回及环周回（岛阈）梨状区（杏仁周区或半月回）——位于钩的背面内嗅区——海马旁回的前部（三）其它扣带回、海马旁回后部、眶回后部和脑岛前部等区域的皮质层结构是同源皮质（新皮质）和异源皮质（古、旧皮质）之间的过渡型，其颗粒细胞较同源皮质少，属中间皮质。其组织结构、纤维联系和功能等均与边缘叶密切相关，故也列入该部。二、皮质下结构（一）杏仁核簇杏仁核簇或杏仁复合体amygdaloidcomplex位于侧脑下角的前内侧和前背侧，钩的深部。其背侧为豆状核、前背侧为前穿质、尾侧连尾状核、外侧连屏状核。杏仁核簇分为两群：皮质内侧核群人类较小，为杏仁核簇的背内侧部，位于半月回的深侧，包括：皮质杏仁核、内侧杏仁核、中央杏仁核、外侧嗅束核、杏仁前区。基底外侧核群人类较发达，包括：外侧杏仁核、基底杏仁核和副基底杏仁核（二）隔区和隔核隔区septalarea和隔核隔区包括胼胝体下区（旁嗅区）和终板旁回的皮质部，形成侧脑室前角的内侧壁。隔核为隔（三）间脑中相关核下丘脑（包括视前区）上丘脑（包括缰核和髓纹）丘脑前核（四）边缘中脑区边缘中脑区位于中脑被盖的内侧部，包括：Tsai腹侧被盖区、脚间核、中脑中央灰质腹侧部、中缝背核、被盖上中央核、背侧被盖核和腹侧被盖核。三、边缘系的纤维联系（一）边缘系的主要通路（二）边缘系皮质间的联系1．扣带联系边缘叶的各部，并将边缘叶与周围新皮质联系起来。2．钩束联系眶回和颞叶前部。3．前连合联系两侧颞叶前部。4．海马连合联系两侧海马。（三）海马的纤维联系1．海马的传入纤维联系内嗅区—穿通纤维—海马、齿状回内侧隔核、斜带核—穹隆—海马、下托胼胝体上回—纵纹—束状回—海马伞—海马边缘中脑区—海马2．海马的传出纤维联系丘脑前核板内核背内侧核缰核海马—穹隆（连合后）——乳头体（连合前）——隔外侧核视前外侧区下丘脑前核斜带回束状回灰被扣带回内嗅区下托下托——内嗅区颞叶的邻近部扣带回内侧额叶的后部杏仁核簇（四）杏仁核簇的纤维联系1．杏仁核簇的传入纤维联系嗅球、嗅前核—皮质内侧核群、外侧嗅束核前梨状皮质—基底外侧核外侧视前区—终纹、腹侧杏仁传出束—杏仁体下丘脑腹内侧核—杏仁体中缝背核、蓝斑、臂旁核、黑质、孤束核—杏仁中央核颞叶前部、眶额皮质、扣带回、脑岛前部、运动皮质—杏仁体2．杏仁核簇的传出纤维联系杏仁核簇—终纹—终纹床核、下丘脑（前核、腹内侧核、内侧视前区）、隔核基底外侧杏仁核—丘脑腹侧传出—外侧视前区、下丘脑外侧区、隔区、斜带核杏仁中央核—下丘脑外侧区、黑质、中脑中央灰质、网状结构、臂旁核、迷走神经背核簇基底外侧杏仁核—杏仁纹体纤维—纹状体杏仁核簇—前额皮质（五）其它纤维联系1．内侧前脑束内侧前脑束medialforebrai