第2章 基因工程 上(西南大学 普通生物学)

基因工程的优点第二章基因工程原核生物与真核生物、动物与植物的遗传信息进行相互重组和转移打破物种界限可实现基因工程研究的理论依据2）基因是可切割1）不同基因具有相同的遗传物质3）基因是可以转移4）多肽与基因之间存在对应关系5）遗传密码是通用的6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第一节DNA重组一、DNA1、核酸的组成与结构DNA是一类由四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）聚合而成的大分子核苷酸分子由戊糖、磷酸和碱基组成。（1）核酸的组成碱基核糖核苷核苷酸（2）DNA的结构单链DNA双链DNA（1）DNA分子能在细胞内复制2、DNA的功能（2）携带遗传信息DNA分子上只有编码基因的片段才能转录合成相应的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。1）DNA分子转录合成RNAmRNATUtRNA核糖体RNA(rRNA)原核生物原核生物2）mRNA翻译合成蛋白质缬酪色二、限制性内切核酸酶和DNA片段化基因工程的关键技术是DNA的连接、重组，但是DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需要的片段。在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开，1、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）一类以环状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中的特定核苷酸序列，产生3'-OH和3'-P基团DNA片段的脱氧核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)。III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。分为I、II、III型酶。基因工程中使用的为Ⅱ酶。限制性内切酶I型酶：先识别，移动后在切割。II型酶：识别处切割DNA。限制性内切酶在DNA分子上能识别的特定核苷酸序列3'CTTAAG5'2、限制性核酸内切酶的识别序列识别序列(识别位点)如：EcoRI的识别序列为5'GAATTC3'不同限制性内切酶产生DNA片段大小Ⅱ型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内3、限制性核酸内切酶的酶切位点同裂酶（isoschizomer）有一些限制性内切酶虽来源不同，但有相同的识别序列。BamHI和BsI具有相同识别序列如：5'GGATCC3'3'CCTAGG5'两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的DNA末端是平齐的。两条链断裂呈交错对称，产生的DNA末端的一条链多出几个核苷酸，成为凸出末端。粘性末端（stickyend）平齐末端（bluntend）限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具有相同的粘性末端。BamHI的识别序列GGATCC同尾酶（isocaudamer）BclI的识别序列TGATCA如：4、限制性内切核酸酶反应系统底物（环状或线状双链DNA）缓冲液温度（37℃）3）部分酶切5、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法1）单酶切2）双酶切三、特异性DNA片段的PCR扩增DNA聚合催化（70-75℃）使引物延伸。1、PCR原理PCR包括3个反应双链DNA变性成单链复性（36-60℃）引物同单链DNA互补序列结合变性（90-95℃）延伸（70-75℃）如此经过25-40次循环。以单链或双链DNA为模板2、DNA聚合酶(polymerase)一种催化由脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶称为依赖DNA的DNA聚合酶DNA聚合酶催化合成DNA互补链的条件四种脱氧核苷5’-三磷酸带有3’-OH游离基团的引物链DNA摸板，双链DNA只有在糖-磷主链上有缺口时，才是有效的摸板。最大特点：耐高温。TaqDNA聚合酶一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶具5’→3’聚合酶活性具5’→3’外切酶活性通过切口平移标记DNA分子，测序。DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌PolA基因编码的一种单链DNA聚合酶PolⅠ有三种不同的酶活性5’→3’的聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性DNA聚合酶Ⅰ的主要用途修补经限制酶消化的DNA所形成的3'隐蔽末端，标记DNA末端，cDNA克隆中第二链的合成，DNA序列测定。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段又叫Klenow聚合酶或Klenow大片段酶是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段分子。Klenow聚合酶的功能5’→3’的聚合酶活性3’→5’的核酸外切酶活性Klenow聚合酶的主要用途T4DNA聚合酶T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶具5’→3’的聚合酶活性3’→5’的核酸外切酶活性用途标记探针DNA片段，DNA测序。合成的长度比其他聚合酶要长T7噬菌体DNA聚合酶来源T7噬菌体感染的大肠杆菌持续合成最强的DNA聚合酶逆转录酶（Reversetranscriptase）主要作用一类依赖于RNA的DNA聚合酶以RNA为模板催化脱氧-5’-三磷酸合成DNA具有RnaseH活性将mRNA反转录成cDNA3、PCR引物5'3'5'3'能够引导模板DNA互补链合成的寡聚核苷酸3'-OH15-30个核苷酸G＋C含量40-60%浓度一般为0.1-0.5µmol/L4、DNA片段扩增系统5'3'5'3'P4P3P1P2巢式/套式PCR（Nestedpolymerasechainreaction）再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物第一次扩增所用引物第二次扩增作用的引物先用一对引物对模板进行扩增因为同两套引物都互补的靶序列很少降低了扩增多个靶位点的可能性外引物内引物主要用于极少量的模板的扩增优点用途反向PCR（reversePCR）扩增引物与PCR序列方向相反主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增不对称PCR（asymmetricPCR）两种引物比例相差较大的PCR用于制备核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针在一通用引物反转录的cDNA3’端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR。锚定PCR可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建降解源自脱嘌呤作用，即DNA分子中碱基和戊糖间的氮糖苷键发生水解。长程PCR长程PCR系统可扩增20kb以上的片段在一般条件下，难以扩增大于5kb的DNA片段主要原因扩增大片段时标准缓冲液在高温下不能保持正常的pH值，从而导致模板DNA降解，由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增反转录PCR（reversetranscriptionPCR）在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段多重PCR（multiplePCR)直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增原位／涂片PCR定量PCR（real-timePCR）PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量荧光定量PCR技术荧光探针:荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5’端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等修饰引物PCR四、DNA片段的化学合成1、合成引物2、合成DNA寡聚合核苷酸连杆（linker）也称为衔接物或接头3、合成基因片段最适温度37℃,五、DNA片段的连接重组1、DNA连接酶（ligase）能够催化两个DNA片段末端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶反应温度一般采用16-20℃。由大肠菌DNA编码的DNA连接酶大肠菌DNA连接酶也能连接用不同内切酶切割产生的平齐末端只能连接具互补粘性末端的DNA片段T4噬菌体DNA连接酶由T4噬菌体DNA编码的DNA连接酶既能连接具互补粘性末端的DNA片段2、DNA片段之间的连接（1）粘性末端DNA片段的连接直接连接转化成平齐末端再连接使DNA平齐末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有poly(A)、poly(T)、poly(G)、poly(C)的粘性末端。（2）DNA末端修饰后的连接1）DNA片段末端修饰酶末端脱氧苷酸转移酶简称为末端转移酶可以切去DNA片段的凸出末端，成为平齐末端。核酸外切酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）催化核酸分子脱掉5'P基团,转换成为5'–OH的酶。碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）使DNA或RNA的去磷酸化，防止DNA的自身环化。主要作用若同聚物不等长，需用DNA聚合酶Ⅰ或Klenow大片段酶填补。再用DNA连接酶连接。同聚物加尾法（homopolymertailing）2）DNA末端修饰后的连接衔接物连接法用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链DNA寡聚核苷酸片段。衔接物（linker）接头连接法接头（adaptor）能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。第二节基因克隆载体载体（vector）（1）多克隆位点（MCS，multiplecloningsite）基因克隆载体必备条件（2）复制原点(ORI,origin)（4）安全能使外源DNA片段插入能进行自我复制（3）选择标记基因一、质粒载体质粒（plasmid）染色体外能自我复制的双链闭合环DNA分子，广泛存在于细菌细胞中松弛型复制质粒在寄主细胞内，能复制几百上千个拷贝。严紧型复制质粒在寄主细胞内，只能复制少数几个拷贝。外源基因插入的多克隆位点（MCS）构建质粒载体一般选用分子小的松弛型复制质粒应具有复制起始点（ori），能够在受体细胞内复制。此外，质粒还有1-2个选择标记基因（Ampr、Kanr、Cmr、Tetr、LacZ'）BR分别为Boliver&Rodrigue首字母缩写1、大肠杆菌质粒载体（1）pBR322质粒p表示质粒氨苄青霉素（Ampr，Tn3）pMB1（类似ColE1质粒，具大肠杆菌素E1合成酶基因）四环素抗性（Tetr，pSC101）基因复制原点选择标记基因多克隆位点（multiplecloningsite）TcR内有11个限制性内切酶位点，其启动子内2个64个限制性内切酶位点ApR内有6个限制性内切酶位点大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶α-肽链的DNA序列(lacZ'基因)（2）pUC质粒载体Messing&Vieria（UniversityofCalifornia）1987年构建pBR322质粒的复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因（ampr）lacZ'内有13个酶切位点的多克隆位点。pUC18pUC19X-Galisanoninducingchromogenicsubstrateforbeta-galactosidase,whichhydrolyzesX-Galforminganintenseblueprecipitate.X-GaIismostfrequentlyusedinconjunctionwithIPTGinblue/whitecolonyscreeningtodetectrecombinants(white)fromnon-recombinants(blue)X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷IPTGinducesactivityofbeta-galactosidase,anenzymethatpromoteslactoseutilization,bybindingandinhibitingthelacrepressor.IPTGisusedtoinducelacZgeneexpressionincloningexperimentsIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷有多克隆位点酵母穿梭质粒载体2、穿梭质粒载体（shuttlevector）能在两种不同的生物（原核生物、真核细胞）中复制的载体有细菌质粒的复制原点及选择