第九章配子与胚胎生物工程-GnRH在动物生殖中的应用

第九章配子与胚胎生物工程第一节配子与胚胎生物工程概述第二节胚胎移植技术第三节其他胚胎工程技术概述1.定义配子与胚胎生物工程也称胚胎生物技术或胚胎工程技术，主要是对动物的卵子、精子和胚胎在体外条件下进行各种操作，以加速繁育经济动物，培育优良品种，或挽救濒危动物使用的一系列工程技术方法第一节配子与胚胎生物工程概述卵子精子受精2.研究内容胚胎移植胚胎分割胚胎冷冻体外受精胚胎干细胞技术转基因技术动物克隆性别控制嵌合体技术母公排卵精子自然交配人工授精体外授精发情鉴定精液保存精子获能IVM显微授精精卵结合胚胎胚胎干细胞胚胎分割胚胎移植胚胎克隆嵌合体转基因诱导发情超数排卵同期发情妊娠妊娠诊断分娩分娩控制助产难产生殖免疫免疫去势类固醇免疫蛋白质免疫基因免疫性别控制分子技术3.研究意义是提高动物生产性能的主要技术措施之一奶牛业乳用型荷斯坦牛的产奶量为各奶牛品种之冠乳牛业发达国家奶牛单产：11吨。品种改良：提高单个奶牛产奶量性别控制：以生产母牛犊谋利肉牛业牛肉人均占有量中国只有4.09千克,与牛肉人均占有量最多的国家澳大利亚250.8千克，阿根廷71.09千克,美国42.74千克,加拿大41.25千克相比，中国牛肉的人均占有量低于世界平均水平。受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛（江苏省农业三项工程项目）养猪业山羊胚胎移植产业化人工授精、试管牛犊、冷冻胚胎、胚胎分割等胚胎工程技术大大加快了畜牧业的发展速度，使得家畜优良品种的生产商品化了。1987年世界上已经有家畜胚胎移植公司200多个，如美国已建立了从事牛胚胎移植、精子冷冻、受精卵分割等技术研究的格拉纳达公司，已发展成资产10亿美元的跨国胚胎企业。揭示胚胎发育、细胞分化等奥秘的研究手段新物种产生的主要技术途径生物制药的主要技术措施之一：胰岛素人类器官移植、修复、再生的主要技术途径人类人工辅助生殖的重要研究手段珍稀濒危动物保护、扩繁的主要手段：克隆，胚胎冷冻等胚胎工程不仅蕴藏着巨大的经济效益，同时对保护珍稀动物和挽救濒临灭绝的野生动物也发挥着重大作用。例如，英国伦敦动物学院和剑桥动物良种繁殖动物学会合作，把斑马的胚胎移植到普通马的子宫里，这匹普通马生出了一批小斑马。中国科学院动物研究所的科研人员研究大熊猫的体外受精取得了很大进展，这将给人工繁殖大熊猫带来希望。人类生殖医学人类生育能力下降：人类将可能面临生育危机，或许这种说法有点危言耸听，但是我们不得不面对这样一个事实：据WHO统计，大约每七对夫妇中就有一对存在着各种程度的生育障碍。男性精液质量在近几十年里有着明显的下降，并且还有逐年递增的趋势。人工辅助生殖技术:试管婴儿和AI试管婴儿技术2008.2.25，中国首例试管婴儿（郑萌珠）20周年庆典人造血液据英国《泰晤士报》2008年8月20日报道，美国先进细胞技术公司的科学家们日前宣布，他们已在实验室中利用干细胞制造出人造血。倘若这一研究成果能继续推广，人类将从此结束献血，血液可以被源源不断地创造出来。也令输血感染致命病毒的风险不复存在。耳朵老鼠动物胚胎工程技术是动物生物技术的重要组成部分之一，在二十世纪后期发展极为迅速，近年来其应用效益最为显著，也是21世纪世界经济增长的重要支撑技术之一。总之，体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞的培养等胚胎工程技术，不仅广泛应用在畜牧业生产中，而且与医学、制药业等的发展，以及人们的生活有着越来越密切的关系。第二节胚胎移植一、胚胎移植技术概述二、胚胎移植的意义三、国内外发展概况四、胚胎移植的基本原则五、牛胚胎移植操作步骤六、山羊胚胎移植概述八戒飞抵岛城跨国娶妻加拿大846头猪运抵青岛，价值190万美元（2007-10-17）成本高，时间长，可用ET代替活体引种。一、胚胎移植技术概述1.定义胚胎移植是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出（或通过体外受精及其他方式得到体外生产的胚胎），移植到另一头同种且生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。实际上是由产生良种胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的技术。牛胚胎移植技术路线示意图着床前早期胚胎的游离状态；不同个体（物种）早期胚胎发育内环境相似；不会发生免疫排斥2.理论基础发挥优良母畜繁殖潜力。羊每年自然繁殖：2－3只，胚胎移植：10－15只。山羊繁殖供体生产胚胎受体妊娠分娩后代二、胚胎移植的意义充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群加速育种进程简化良种引进方法保存品种资源诱发单胎动物产双胎研究手段在胚胎移植中，供体母畜职能是生产遗传性能优秀的胚胎，而胚胎后期发育完全可以由遗传性能一般的代孕受体来完成。母畜再通过促性腺激素处理后，一个发情周期中生产的胚胎数将比自然状态多几倍到几十倍，通过胚胎移植其繁殖力可提高几十甚至是几百倍。1.充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群以奶牛为例，按照目前的技术水平，供体母牛每隔60d可进行超排处理一次，每次能获得可用胚胎4-5枚，一头良种母牛每年能生产可用胚胎25-30枚，移植到受体内能获得12-15头犊牛，而在自然状态下，一头母牛平均每年只能获得一头犊牛。JIVET技术简介JIVET：juvenileinvitroembryotransfer幼畜胚胎体外生产与移植JIVETJIVET––howisitdone?howisitdone?EggsmaturedEggsfertilisedEggsaspiratedHormonetreatment(age4-8weeks)LambsEmbryostransferred激素诱导后的犊牛卵巢•充分利用优良母畜的遗传资源(多)•缩短世代间隔，加快育种进程（快）2.加速育种进程MOET(multipleovulationandembryotransfer)技术能大幅度提高母畜繁殖力，扩大优秀母畜在群体中的影响，增加后代选择强度。如在奶牛育种中，MOET技术能获得更多具有高产性能的半同胞和全同胞，在较短的时间内达到后裔测定所要求后代的数量，提早完成后裔测定工作，增加选择强度和准确性，缩短育种进程。应用MOET核心群育种方案，公牛的遗传评定时间可缩短40％，生产性状的年遗传进展比常规的人工授精提高20％左右。如果在青年母牛或母羊中应用活体采卵和胚胎移植技术，年遗传进展可提高30％-70％。3.简化良种引进方法活畜引进不仅价格高、运输不便、检疫和隔离程序复杂，而且还存在风土驯化的问题。胚胎移植与胚胎冷冻技术相结合后，良种的引进可简化为冷冻胚胎的引进，不仅运输方便、检疫程序简单、成本低廉，而且后代对引种地生态环境适应性和抗病力增强。目前，牛羊胚胎移植与冷冻技术已成为国际、地区间良种遗传资源交流廉价而简便的方式。4.保存品种资源结合胚胎冷冻技术为可保存国家或地区间特有的家畜品种资源，建立种质资源库提供新的技术手段，还可降低种质资源保存费用。活畜保种不仅成本很高、规模有限，而且还容易发生基因漂变。胚胎冷冻保种也优于精液冷冻保种，因为一个胚胎是一个完整的个体，这样，冷冻或冷藏一个胚胎不仅保存了一个个体的基因，也保存了基因组织。而且要从精子中重新构建一个已经灭迹了的群体，需要级进许多世代，而通过胚胎再构建一个群体，仅在一个世代内即可实现。胚胎冷冻保种不仅成本低廉、方法简单，而且能避免活畜保种因疾病、自然灾害或基因漂变造成种质消亡的风险。5.诱发单胎动物产双胎性别控制避免异性孪生不育症6.研究手段目前，胚胎工程技术中应用最多的是胚胎移植技术，无论是转基因胚胎还是克隆等获得的胚胎，最后都必须经胚胎移植才能获得后代，胚胎移植是胚胎工程的最后一道“工序”。因此，可以说它是胚胎工程技术的基础。三、国内外发展概况胚胎移植技术是20世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术。•1951年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛。•1976年，牛非手术法胚胎移植获得成功。1.胚胎移植历史1890年英国第一次兔获得胚胎移植成功1934年绵羊1949年山羊1951年猪1951年牛1970年马1975年1月美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会1980年代欧洲使用MOET奶牛育种国际间胚胎贸易非常活跃，早在1994年，全世界仅胚胎移植牛就已超过350,000头，其中进出口的胚胎约占总数的10%。近年来，国际上胚胎的产量和贸易量则成倍增长。2.发展前景•我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成。•农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；•胚胎移植技术作为扩大良种牲畜数量的一种最好手段，将在畜牧业生产中起到越来越大的作用，胚胎移植技术产业化前景十分广阔。四、胚胎移植的基本原则移植前后所处的环境应是相同或相似的移植的时间要适宜胚胎的发育应当正常供体和受体在种属上必须一致；供体和受体在生理上必须一致：供、受体在发情时间上应同期化，一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降；从供体中收集胚胎的部位与给受体移植胚胎的部位必须一致：即从供体子宫角内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫角内。1.移植前后所处的环境应是相同或相似的Follicular(egg)development,hormonalchanges,endometrial(uterinelining)changes胚胎收集与移植的时间不能超过周期黄体的寿命，因此，胚胎的收集时间不能超过发情配种后第7天，最好是在发情配种后的第5-7天内进行。2.移植的时间要适宜胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响。同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植。3.胚胎的发育应当正常五、牛胚胎移植操作步骤供、受体牛的选择供体的超数排卵与人工授精受体的同期发情胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的移植1.供、受体的选择供体应是良种，而且为性状表现优秀、具有较高育种价值与遗传优势的个体；供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳；供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。1.1供体母畜的选择一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型；要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同；应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群。1.2受体母畜的选择2.1超排定义在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称“超排”。2.供体的超数排卵与人工授精牛有PG+FSH法和CIDA+FSH法两种；发情后9－13天开始；常用的激素为FSH；注射方法一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时（半衰期短）；发情后8－12小时配种，间隔12小时再配种一次。2.2超数排卵方法在发情周期第10、11、12、13天每头牛分别肌注FSH160、140、110、90单位（共500IU)，每天分两次注射，在第12天注射FSH的同时肌注PG，上午2支/头，下午1支/头。发情后供体AI或配种2-3次。供体牛的超排方案3.受体的同期发情3.1定义利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。缩短黄体期的前列腺素法(PG法)延长黄体期的孕酮法3.2同期发情方法PGF2α有溶解黄体的作用，从而引起发情，所以只对卵巢上存在黄体的受体有效。在情期第9天以后，注射PGF2α，常可在注射后2-3天内发情(WHY?)。对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔10-12天的两次注射法。此方法方便可靠，但费用较高。为何要进行两次注射？3.2.