第二章临床生物化学实验室基本技术与管理

1第二章临床生物化学实验室基本技术与管理实验室的基本技术与管理是临床生物化学检验工作的重要基础。本章所涉及的实验室基本技术与管理主要是应用于临床生物化学检测的分析技术与质量管理，目的在于加强基础，提高生物化学检验的质量。对于实验室的其他基本知识，基本技术以及实验室的管理方法，可参阅其他相关教材。第一节常用临床生物化学分析技术临床生物化学分析技术很多，常用的主要有光谱分析技术、电泳技术、离心技术、层析技术、电化学分析技术等。一、光谱分析技术利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。分光光度法(spectrophotometry)I.光谱分析法(photometry)1.定义：根据物质吸收、发射或散射辐射能而建立起来的一类分析方法。2.光的基本性质：高速传播的电磁辐射；具有波动性(=c/v)和微粒性(E=hv)；短波能量大，长波能量小3.物质对光吸收的基本原理：能量转移----当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移至分子、原子上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。选择吸收----组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱。2吸收激光发谱发e.g.,射荧光光谱E=E1-E2=hv能量释放----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。4.分类(1)吸收光谱分析法：根据溶液能吸收由光源发出的某些波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。(2)发射光谱分析法：根据物质受到热能或电能等的激发后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。(3)比浊/散射光谱分析法：测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度的一类定量方法。激发态(E1)基态(E0)可见、紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry)*原子吸收光谱法(atomicabsorptionspectrophotometry)：微量金属元素红外分光光度法火焰发射光谱法(flameemissionphotometry)：碱金属/碱土金属元素荧光光谱法(fluorometry)：少量无机物、酶活力、激素等3比浊法(turbidimetry)：在光源的光路方向上测定透射光强度(透射光&散射光)与入射光强度的比值和胶体溶液中质点浓度间的关系。散射测浊法(nephelometry)：在光路的垂直方向上测量散射光强度和胶体溶液中质点间的关系。5.特点：灵敏度高；测定简便、快速；试样不被破坏等。II.可见、紫外分光光度法1.定义：根据物质分子对于200nm~700nm光区电磁辐射的吸收特性进行分析的方法。可见光：400~700nm,有色物质溶液紫外光：200~400nm,无色物质2.特点：灵敏度高(10-4~10-7g/ml);选择性强；精确度和准确度高；仪器设备简单，操作易掌握3.吸收光谱(1)光谱的产生：化合物分子的价电子跃迁(2)吸收光谱曲线：电子跃迁的吸收波长和吸收强度可用仪器测定，在可见、紫外光区内绘制或扫描得到一条以波长()为横坐标,吸光度(A)为纵坐标的吸收曲线。4.光吸收的基本定律(Lamber-Beer’sLaw)(1)定律：单色光通过吸光溶液后，吸光度与浓度或厚度之间呈正比关系。Lamber定律：说明吸收与厚度间的关系Beer定律：说明吸收与浓度间的关系(2)表达式：4-lgIt/Io=abc*It/Io为透光率(transmittance,T)(%)A=-lgT=abc*A为吸光度(aborbance)*a为吸光系数(absorptivity),即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。b为液层厚度c为溶液浓度(concentration)5.比色法(colorimetry)(1)定义：用可见光作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法(2)所用仪器：分光光度计(spectrophotometer)(i)基本原理：溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，故当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系。(ii)结构组成(以722分光光度计为例)光源：可见光区的光源为钨灯，波长范围是320~1000nm。(紫外光区的光源为氢灯或氘灯，波长是200~320nm)单色器：一种将光源产生的混合光分解为单一波长的光学系统。一般是根据通过棱镜的折射或光栅的衍射而获得的。试样室：由比色皿座架及光门组成。可见光区用光学玻璃比色皿(紫外光区用石英比色皿)光电管暗盒：由光电管(可将光能转变为可以放大检测和记录的电能)和微电流放大器组成。5显示器：由放大器和读数元件组成。(3)比色法的定量方法：(i)标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。(ii)对比法：将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测样品浓度Cx=CsAs/AxIII.实验内容1.可见光分光光度计波长校正(1)原理：镨钕玻璃是一种含有金属镨与钕的玻璃制品，在可见光波长范围内，它具有特征性的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作校对仪器波长正确性的依据。(2)操作：用镨钕玻璃与空白光路作对照，作出波长从512~541nm的镨钕玻璃吸收曲线，以横坐标为波长，纵坐标为吸光度，每隔2nm作一个点，查找529nm处是否有一个吸收峰的极值，若这个吸收峰的极值相对应的波长大于529nm，则反时针方向调节波长调节螺杆，使这个极值相对应地靠近529nm，一直调到波长误差在允许范围内(5292nm);反之，吸收峰极值相对应的波长小于529nm，则顺时针方向调节螺杆。2．红蛋白及衍生物吸收光谱测定(见书)分光光度计的使用1．开电源开关，打开箱盖，预热10mins2．将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁。3．选定波长4．打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空白管调T=065．盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏度开关)6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0，否则调节“消光零”旋钮调至0。7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值A。8．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关。二、电泳技术电泳Electrophoresis一、定义电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。二、电泳分析技术发展概况1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进7行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“LastCheck”。由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少分析电泳制备电泳2.根据电泳电压的高低常压电泳0～500V高压电泳500～3000V3.根据电泳中是否使用支持物自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳—使用支持物(1)按支持物的物理性状不同，可分为①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳(2)按支持物的装置形式不同，可分为①平板式电泳②垂直板式电泳③垂直柱式电泳4.根据电泳系统pH是否连续连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如PAGE、IFE优点是在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高.电泳技术应用基础理论研究;临床诊断;工业制造.8双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能.四、电泳的基本原理一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：F’=6πrηυ式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ=d/t，单位时间粒子运动的距离，cm/s)。当带电分子匀速移动时：F=F’，∴q•E=6πrηυ由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。VQM=-----------=-----------E6r五、影响电泳速度的因素1.电场强度（E）E↑→