第二章微生物实验室常用试剂、培养基

1微生物学实验室常用试剂与培养基第一节常用试剂及其使用方法一、诊断用纸片⑴杆菌肽纸片（0.04U/片）：抑菌圈10mm为敏感。质控菌株:D群链球菌阴性,A群链球菌阳性。⑵SMZ纸片（1.25μg/片、23.75μg/片）：出现抑菌圈即为敏感。质控菌株：D群链球菌阳性，A群链球菌阴性。⑶新生霉素纸片（5.0μg/片）：抑菌圈≥16mm为敏感。质控菌株：表皮葡萄球菌阳性，腐生葡萄球菌阴性。⑷O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片：参见第五节《生化试验培养基》。二、诊断用血清1.沙门菌属诊断血清⑴A-F群O多价诊断血清。⑵特异O群因子诊断血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10诊断血清。⑶特异H因子诊断血清常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子诊断血清。2.志贺菌属诊断血清志贺菌属4种多价血清：痢疾志贺菌Ⅰ、Ⅱ血清，福氏志贺菌多价血清及分型血清（1～6型），宋内志贺菌诊断血清，鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。3.致病性大肠埃希菌诊断血清肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清，产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清，肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清，肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157：H7。4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清6.链球菌分类诊断血清7.肺炎链球菌诊断血清8.耶尔森菌诊断血清三、常用染色液1.革兰染色液⑴结晶紫溶液A液：结晶紫20g，95%乙醇20ml；B液：草酸铵0.8g，蒸馏水80ml。染色前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。⑵碘液:碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水,使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。⑶脱色液：95%乙醇⑷复染液：沙黄2.5g，95%乙醇100ml为贮存液，取贮存液10ml，加蒸馏水90ml为应用液。2.抗酸染色液⑴碱性复红染色液：①萋纳石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。②脱色液：浓盐酸3ml，95%乙醇97ml。③复染液(吕弗勒美蓝液)：美蓝乙醇饱和溶液30ml，100g/L氢氧化钾溶液0.1ml，蒸馏水100ml。⑵金胺O-罗丹明B染色液：①罗丹明B液：罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml。②1g/L金胺O液：金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸25ml,混匀。③3%盐酸乙醇。④稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。3.鞭毛染色液(改良Ryu法)A液：5%石炭酸10ml，鞣酸2g，饱和硫酸铝钾溶液10ml；B液：结晶紫乙醇饱和液。应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。4.异染颗粒染色液甲液：甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿2g/L，95%乙醇2.0ml，蒸馏水100ml。乙液：碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后,加蒸馏水至300ml。5.荚膜染色液⑴印度墨汁或50g/L黑色素水溶液⑵5g/L苯胺蓝水溶液。第二节基础培养基一、液体基础培养基1.蛋白胨水[用途]用于细菌靛基质试验；一般细菌培养和传代。[配法]蛋白胨（或胰蛋白胨）10g，氯化钠5g，蒸馏水1L。将上述成分溶于水中，校正pH至7.2,分装试管，每管2~3ml，置121℃灭菌15min备用。[质量控制]大肠埃希菌生长良好，靛基质阳性；伤寒沙门菌生长良好，靛基质阴性。2.营养肉汤[用途]一般细菌的增菌培养，加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。[配法]蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L。将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH至7.4，按用途不同分装于烧瓶或试管内。经121℃灭菌15min，作无菌试验后冷藏备用。[质量控制]金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌生长良好。[保存]置冰箱3周内用完。3.牛肉浸液培养基[用途]细菌培养最基础的培养基，除用于一般细菌的培养外，又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。[配法]新鲜除脂牛肉500g，氯化钠5g蛋白胨10g，蒸馏水1L。先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切块绞碎。称取500g置容器加入蒸馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后，用氢氧化钠溶液校正pH至7.6~7.8，并加热煮沸10min，补充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，经121℃15min灭菌备用。[用法]根据用途不同可以制成营养肉汤，以此为基础制成其它培养基。如制作固体培养基，加入琼脂15~20g/L即可。[质量控制]金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。[保存]置4℃冰箱内可以使用较长时间。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量为33～5g/L。二、固体基础培养基1.营养琼脂[用途]一般细菌和菌株的纯化及传种。[配法]蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉（优质）12g，蒸馏水1L。将上述成分(除琼脂外)溶于水中，校正pH7.2～7.4后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经121℃灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。[质量控制]金黄色葡萄球菌菌落呈浅黄色；痢疾志贺菌菌落无色；铜绿假单胞菌菌落无色或浅绿色。[保存]置4℃冰箱保存，2周内用完。2.血琼脂培养基[用途]一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种。[配法]pH7.4~7.6牛肉浸液琼脂100ml，脱纤维羊血(或兔血)5~10ml。将血琼脂基础经121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右以无菌手续加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿内，待凝固后，经无菌实验冷藏备用。[质量控制]化脓性链球菌ATCC19615生长良好，β-溶血；肺炎链球菌ATCC6303生长良好，α-溶血；表皮葡萄球菌ATCC12228生长良好,不溶血。[保存]置4℃冰箱，1周内用完。3.巧克力琼脂培养基[用途]主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。[配法]鲜牛肉浸出液1L，蛋白胨10g,氯化钠5g，琼脂粉12g，无菌脱纤维羊血或兔血100ml。将上述成分（除兔血外）加热溶解，调pH至7.2，置121℃15min高压灭菌，待冷至约85℃，以无菌方式加入兔血，摇匀后置85℃水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。取出置室温冷至约50℃，倾注平板或制成斜面备用。[质量控制]流感嗜血杆菌ATCC10211、肺炎链球菌ATCC6305生长良好，菌落典型。[保存]置4℃冰箱，1周内用完。4.胱氨酸胰化酪蛋白琼脂[用途]常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。[配法]胱氨酸0.5g,胰化酪蛋白20g,氯化钠5g，亚硫酸钠0.3g，琼脂3.5g，酚红0.0175g，蒸馏水1L。将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。分装试管，115℃灭菌15min。[用法]用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35℃孵箱，18~24h观察结果。培养基由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。4第三节保存和增菌培养基一、菌种保存培养基[配法]蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，琼脂粉4.5g，蒸馏水1L。将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.4~7.6，分装试管2/3左右高度，121℃高压灭菌15min，成为半固体培养基，备用。[质量控制]培养基呈淡黄色半固体状。大肠埃希菌(ATCC25922)生长良好,动力阳性；福氏志贺菌(ATCC12022)生长良好,动力阴性；金黄色葡萄球菌(ATCC25923)生长良好,动力阴性。二、增菌培养基1.葡萄糖肉汤[用途]用于血液增菌。[配法]蛋白胨(或月示胨)10g，氯化钠5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸橼酸钠3g，5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，青霉素酶1000U。将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50U，经无菌试验合格后，冷却备用。[用法]将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35℃培养箱内，每天1次取出观察结果。如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7d，仍无细菌生长方可弃去。在观察的过程中，至少应作两次分离培养。注:⑴枸橼酸钠为抗凝剂，可使血液加入培养基中不凝固。⑵对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。⑶硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。⑷本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体的抗药作用从而提高检出率。2.血液增菌培养基[用途]血液和骨髓液病原菌的增菌培养。[配法]蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸橼酸钠3g，磷酸氢二钾2g，5g/L对氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，4g/L酚红溶液6ml，青霉素酶50U，聚茴香脑磺酸钠(SPS)0.3g，蒸馏水1L。将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶30～50ml，经121℃灭菌15min和35℃24h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.5～2.5U青霉素酶。[质量控制]伤寒沙门菌ATCC50096、白色念珠菌ATCC10231、化脓性链球菌ATCC19615、肺炎链球菌ATCC6305、金黄色葡萄菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853均生长良好。3.亚硒酸盐增菌培养基[用途]沙门菌增菌培养。[配法]蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氢二钠54.5g，磷酸二氢钠5.5g，亚硒酸氢钠4g，蒸馏水1L。先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH7.0~7.1(通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15×150mm的试管内，每管10ml。置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷却，置4℃冰箱保存备用。[用法]取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35℃培养过夜。如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等，进行培养。[质量控制]培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。增菌灵敏度：伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7。[保存]4℃保存，1周内用完。注：⑴亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用，但以亚硒酸氢钠效果为好。⑵磷酸盐缓冲对中，两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试，其总量为10g/L。⑶在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物。⑷培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。4.SS增菌液[用途]用于沙门、志贺菌的增菌。[配法]月示胨2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g，酵母膏2g，葡萄糖2g，枸橼酸铁10g，硫代硫酸钠10g，亚硫酸钠0.7g，胆盐5.5g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0.1g，去氧胆酸钠(进口)1.5g，煌绿0.005g，蒸馏水1L。将上述成分加热溶于水中，调pH至7.1，分装试管（15×150mm），每管5~7ml，隔水煮沸5