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第五章分子生物学研究方法1、重组DNA技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术3、基因克隆的主要载体系统4、基因的分离与鉴定分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等3个环节。5·1重组DNA技术史上的重大事件半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就:第一，解决了遗传的物质基础问题－－基因的分子载体是DNA;第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后，大量类似于EroRl但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。5·2DNA操作技术植物基因组DNA的提取：液氮对植物组织进行研磨－－破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。材料1·三羟甲基氨基甲烷(Tris)2·乙二胺四乙酸(EDTA)3·氯化钠4·－巯基乙醇5·氯化钾6·异丙醇7·乙醇8·琼脂糖9·十二烷基硫酸钠(SDS)10·EP管11，陶瓷研钵12·加样枪和吸头13·氯仿14·酚试剂1·细胞提取液（100mmol/LTris·HCl=50/26.8pH8·0）(100mL分装为10mL)，5mmoI/LEDTA，500mmol/LNaCl1.25%SDSlmol/L－琉基乙醇2·5mol/LKCl将细胞提取液、KCl溶液及容器灭菌。新鲜叶片，在液氮中研磨，分装在2只EP管中。加入740L细胞提取液，充分混匀。65℃水浴保温20min。从水浴中取出离心管，加入20L5mol/LKCl溶液，混匀，冰浴20min。8000r/min离心10min。将上清液转移到另一EP管中。加等体积酚/氯仿混匀，2000r/min离心5min，取上清。加等体积氯仿，混匀，12000r/min，离心5min，取上清。加入0·6～1倍体积的异丙醇(沉淀DNA)，混匀。离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。风干沉淀。5·2·1核酸的凝胶电泳1·基本原理生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。第五章分子生物学研究方法2·琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05μg的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。5.2.2核酸的分子杂交将特定的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去的，因此，核酸杂交也被称为DNA印迹杂交。由于该方法是E·M·Southern于1975年首先设计出来的，所以又叫做Southernblotting。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（印迹转移）;第二，将滤膜与DNA或RNA探针进行杂交。具体步骤：1、转移。2、在80℃下烘烤1～2h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。4、用漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测2ng；为了安全，我们用DIG（地高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号。基因组DNA被限制性内切酶酶切为DNA片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带；（c）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作用将凝胶上的DNA条带原封不动地吸印到滤膜上去。（d）在80℃下烘烤1～2h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。(e)滤膜放入带标记的DNA或RNA核酸探针溶液中进行核酸杂交。5·2·3细菌转化细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀(形成原生质球)，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。发生了遗传改变的菌株带着变异而遗传。5·2·4核苷酸序列分析仪器分析发展很快。如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。5·2·5基因扩增聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动(引导)新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。PCR反应的全过程DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。具体说：首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(约94℃)环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；然后降低反应温度(约56℃)制冷1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→3’方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。5·3基因克隆的主要载体系统5·3·1质粒DNA及其分离纯化细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由环形双链DNA组成的复制子（有少量线性质粒、RNA质粒报道）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒用作基因克隆的载体分子，获得大量纯化的质粒DNA分子很重要。寄主细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤，加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS)来促使大肠杆菌细胞裂解。细胞裂解反应需要相当温和，同时实验操作又十分谨慎仔细，这样，绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度的质粒DNA。5·3·1·1氯化铅密度梯度离心法质粒DNA一般仅占细胞总DNA的l%～2%左右，而且其化学结构与寄主染色体DNA之间并没有什么差别，所以，质粒DNA的纯化须从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子质量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。方法：将含有溴化乙锭(EtBr)的氯化铯(CsCl)溶液加到大肠杆菌裂解液中，EtBr分子便会通过嵌入作用而结合到DNA链上，导致双螺旋结构发生解旋反应。大肠杆菌染色体DNA片段具有游离的末端而易于解旋，会结合大量的EtBr分子。共价闭合环状的DNA分子质粒，只能发生有限的解旋反应，限制了EtBr分子的结合数量，染色体DNA片段比质粒DNA结合更多的EtBr分子。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要比线性的染色体DNA片段具有更高的密度。通过氯化铯密度梯度离心之后，它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。5·3·1·2碱变性法在pH值介于12.0～12.5的条件下加热DNA溶液，线性DN