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第五章微生物酶的工业提取酶分离纯化的基本原则1.防止酶变性失效(1)一般在低温下进行(2)控制pH不要过酸、过碱(3)尽量减少泡沫(4)防止重金属、有机溶剂引起酶变性,防止微生物污染和蛋白酶水解。2.选择有效的纯化方式(1)在不破坏待纯化酶的限度内,使用各种“激烈”手段。(2)使用亲和剂进行纯化。3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。微生物酶制剂工业提取的一般步骤胞内酶:分离收集菌体-破碎-抽提胞外酶:深层培养液或固体培养的抽提液离心或过滤-去杂-浓缩-沉淀分离(盐析、有机溶剂沉淀等)-干燥-加工不同剂型产品第一节酶抽提液的制备一、胞内酶的抽提液二、深层培养液(或抽提液)的过滤三、酶抽提液的去杂一、胞内酶的抽提液(一)胞内酶在细胞内分部概况(二)细胞破壁方法(三)破碎检查(一)胞内酶在细胞内分部概况1.在细胞壁内,游离在细胞浆里与外围细胞浆里。2.牢固结合在细胞器或细胞膜上。(二)细胞破壁方法1.机械法2.物理法3.化学法4.酶解法1.机械法通过机械切力的作用使细胞组织破碎的方法。如:高压匀浆器的挤压冲击。2.物理法通过物理作用使细胞组织破碎的方法(1)反复冻融法(2)冷热交替法(3)超声波振荡法3.化学法(1)丙酮干燥法(2)表面活性剂处理4.酶解法(1)自溶法(2)溶菌酶法(三)破碎检查1.直接测细胞破碎2.测释放出的蛋白的量3.测酶活力二、深层培养液(或抽提液)的过滤(一)添加絮凝剂(二)添加凝固剂(沉淀剂)(三)添加助滤剂(四)提高温度处理(一)添加絮凝剂1.为何进行絮凝处理2.絮凝作用原理3.常用絮凝剂1.为何进行絮凝处理酶的发酵液是一种胶体溶液,固液分离比较困难,原因是:(1)细菌细胞微小(2)细胞表面带有负电荷(3)-COOH、-NH2、-OH等各种基团形成水化层2.絮凝作用原理絮凝剂中和了悬浮粒子表面的电荷,与胶体粒子表面基团之间形成架桥絮凝。3.常用絮凝剂(1)无机絮凝剂(2)有机絮凝剂三、酶抽提液的去杂(一)阳离子沉降除杂(二)表面活性剂沉淀除杂(三)无机盐凝胶沉淀除杂四、酶抽提液的浓缩(一)真空低温蒸发浓缩(二)超过滤浓缩第二节酶的沉淀方法之一:盐析法酶(蛋白质)的沉淀:添加某些试剂或者改变某些环境条件,致使酶(蛋白质)离开溶液,形成不溶性颗粒的过程。盐析:蛋白质在高浓度的中性盐溶液中沉淀析出。一、盐析的基本原理二、盐析剂中性盐的选择三、盐析剂用量的确定四、分部盐析法一、盐析的基本原理1.酶蛋白溶液是稳定的亲水胶体2.盐析的基本原理3.盐析过程二、盐析剂中性盐的选择盐析常用的中性盐:硫酸铵最常用。原因:(一)溶解度大(二)温度系数小(三)盐析效果好(四)来源容易,价格便宜三、盐析剂用量的确定例:以硫酸铵盐析糖化酶糖化酶的盐析曲线四、分部盐析法1.分部盐析法2.盐析曲线3.两种酶的分离第三节酶的沉淀方法之二:有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀蛋白质的原因:1.有机溶剂加入酶溶液会使溶液的介电常数降低2.有机溶剂加入酶溶液可能会破坏酶或蛋白质中的某些键,导致疏水基团外露,形成疏水层。一、有机溶剂的选择二、有机溶剂用量的确定三、温度对有机溶剂沉淀酶的影响(一)温度低沉淀完全(二)温度升高,已沉淀的蛋白质可能复溶(三)温度降低,原先溶解的蛋白沉淀,影响酶纯度(四)有机溶剂与水混合会放出大量的热,使酶液温度升高四、实例有机溶剂沉淀法制取食品级α-淀粉酶工艺流程说明:1.发酵液预处理2.压滤3.浓缩4.沉淀5.压滤6.干燥第四节液体浓缩酶和酶的干燥一、液体酶制剂的制备二、酶的干燥一、液体酶制剂的制备(一)液体酶的制造:发酵液经过滤-除杂-浓缩后,添加防腐剂和稳定剂-成品(二)液体酶的保存1.添加防腐剂2.添加稳定剂二、酶的干燥(一)冷冻干燥(二)直接干燥(三)喷雾干燥(一)冷冻干燥(二)直接干燥工业粗酶可用烘箱、烘房直接干燥,但注意温度不能太高。(三)喷雾干燥喷雾干燥流程示意图
本文标题:第五章微生物酶的工业提取
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