肝癌细胞生物学行为改变涉及p120ctn酪氨酸磷酸化_百替生物

@100biotech.com肝癌细胞生物学行为改变涉及p120ctn酪氨酸磷酸化黄华艺农朝赞郭凌宵（广西民族医院530001）[摘要]目的观察p120ctn磷酸化与肝癌细胞生物学行为的关系，探讨p120ctn肝癌细胞粘附和信号转导中的作用。方法使用免疫沉淀和免疫印迹法检测EGF引起的p120ctn磷酸化情况，用免疫细胞化学技术观察p120ctn在细胞内的分布、转位和形态学改变，用相应的方法检测细胞粘附和迁移情况，反义核酸技术用于反义p120ctn的转染。结果EGF可使p120ctn酪氨酸发生磷酸化，以作用20min时最明显；磷酸化后的p120ctn发生了转位，膜表达减少，核表达增加，-catenin也发生相似的改变；细胞粘附能力下降，迁移能力增加，细胞形态变为细长和不规则，伪足增多。结论p120ctn在细胞粘附和酪氨酸蛋白激酶信号转导途径中起重要作用。提示p120ctn酪氨酸磷酸化与肝癌发生和转移过程存在某种联系。[关键词]酪氨酸磷酸化肝癌连环蛋白p120P120ctnTyrosinePhosphorylationAreInvolvedinHepatocellularCarcinomaCellBiologicBehaviorChanges†HUANGHua-yi1*,NONGChao-zan1,GUOLing-xiao1,ZHAXi-liang2§.GuangxiNationalitiesHospital,GuangxiNanning530001,China【Abstract】ObjectiveInordertoinvestigatetherelationshipbetweenp120ctnphosphorylationandofbiologicbehaviorslivercancercellsforfurtherexploringtheroleofp120ctninhepatocellularcarcinomacelladhesionandsignaling.MethodsPhosphotyrosineofp120ctnweredetectedbyimmunoprecipitationandimmunoblotting.Thecellulardistributionandtranslocationofp120ctnand-cateninandcellmorphologychangesweredetectedandexaminedbyimmunocytochemistry.Celladhesionandmigrationabilitieswerealsodetectedusingcorrespondentmethods.Antiseuse-nucleotidemethodwereusedinanti-p120ctntransfection.ResultsPhosphorylatedtyrosineofp120ctnhadbeenobservedafterEGFstimulation,Thetyrosinephosphorylationlevelwassignificantat20minafterEGFstimulationcompariedtocontrol.Phosphorylatedp120ctntranslocatedintonucleus,itsmembranedistributionwasreduced,andsamechangesof-cateninwerefoundwhilecomparedwithp120ctn;Celladhesionabilitiesreducedandmigrationabilitiesincreased,cellmorphologybecamethin,elongatedandirregular,theirspeudopodsincreased.Conclusionp120ctnplayanimportantroleinhepatocellularcarcinomacelladhesionandproteintyrosinekinasesignalingcascade.Itsuggestedthatthereisarelationshipbetweenp120ctntyrosinephosphorylationandhepatocellularcacinomaoccurrenceandmetastasis.【Keywords】P120ctn;HepatocellularCarcinoma;TyrosinePhosphorylation作者单位：广西民族医院中心实验室（黄华艺，农朝赞，郭凌宵），广西南宁530001，†作者现在地址：Departmentofpharmacology&therapeutics,RoswellParkCancerInstitute,SUNYatBuffalo.Email:[e-mail]‡通讯作者：查锡良，复旦大学医学院卫生部糖复合物重点实验室、生物化学教研室，上海200032.Email:[e-mail]*广西自然科学基金资助，[e-mail]连环蛋白（Catenin）是一组细胞内糖蛋白，它们的分子中均具有重复的Armadillo样结构，并通过这个结构与经典的钙粘蛋白的胞内肽段结合，形成钙粘蛋白-连环蛋白复合体（Cadherin-catenincomplex,CCC），这个CCC在上皮细胞的细胞-细胞粘附中起关键作用。连环蛋白至少可分为、、（桥粒斑珠蛋白）和p120四大类，其中-catenin和-catenin在胞内相互竞争与E-cadherin胞内肽段结合，-catenin则一端与-catenin或-catenin结合，另一端与肌动蛋白细胞骨架结合。P120ctn是一个发现不久的连环蛋白成员，过去称为p120CAS（CadherinAssociatedSrcSubstrate）[1]。研究发现，p120ctn一端与E-cadherin的胞内肽段近膜端结合，而另一端可能与一种新的被称为“Kaiso”的转录因子结合，对基因转录起调控作用[2]，但两者在基因转录中的详细作用机制未明。已证明Catenin是细胞信号转导分子和粘附分子，参与由E-cadherin介导的细胞内信号转导，在细胞粘附、增殖和细胞命运过程中起重要作用。最近E-cadherin已被认为是一种抑癌基因[3]，而-catenin被认为是一种癌基因[4]，p120ctn是Cadherin介导的细胞内信号转导和细胞粘附的调节因子[5,6]。近几年来发现这些信号分子与肿瘤的发生、发展及转移有密切关系[7-9]。-catenin和-catenin磷酸化可导致它们与E-cadherin分离并发生转位，对细胞的增殖产生影响，但p120ctn磷酸化后的去向和对细胞的增殖、细胞粘附行为的影响未见报道。我们试图通过探讨p120ctn磷酸化后对肝癌细胞生物学行为的影响，进一步揭示p120ctn与恶性肿瘤发生、发展和转移之间的关系。材料与方法一、材料1、细胞：BEL-7404人肝癌细胞系引自中科院上海生化细胞所。2、化学试剂和细胞因子:DMSO、EDTA、Fibronectin、Phosphataseinhibitorcocktail2、Proteaseinhibitorcocktail、Anti--Tubulinantibody和Anti-MouseIgG-HRP购自Sigma；CalibratedMolecularWeightsofKaleidoscopeStandards和PVDF膜购自Bio-Rad；EGF和ECL购自AmershamPharmaciaBiotech；CaliculinA、RPMI1640、FBS、HEPES和ProteinGAgarose购自GIBCOLBRLLifetechnologies；BSAfractionV为Roche产品；Mouseanti-p120和anti-phosphotyrosine单抗购自B-DTransductionLaboratory。3、器材：二氧化碳培养箱为美国Harris;MicroplateReader550为Bio-Rad，带有490nm和540nm滤光片，X-光胶片和自动洗片机均为KODAK。4.其他：人全长p120ctn反义核苷酸在中科院上海生化所设计，上海生工公司合成。序列如下:5’-End:5’3’GTCCCATCATCTGAGGT3’-End:5’3’CTGGATAACCATCTTCATAG二、方法1.细胞培养：细胞在含10%FBS的RPMI1640培养基，5%CO2,37℃条件下生长。2.p120ctn磷酸化方法：参照Hazan的方法进行[10]。即生长在60mmdish中的细胞达到融合，换无血清培养液继续培养36hr以饥饿细胞，然后用EGF刺激以使p120ctn酪氨酸残基磷酸化。细胞分组如下：A组：已饥饿的BEL-7404细胞以200ng/ml的EGF刺激10min,20min,30min；B组：细胞在EGF刺激前48hr给予CaliculinA5nmol·L-1（抑制磷酸酶），然后再给EGF刺激10min,20min,30min；C组：细胞先转染p120ctn反义核苷酸3A24hr后再给予EGF刺激10min,20min,30min。D组：细胞给予0.1%DMSO处理48hr。E组：细胞不作任何处理。p120ctn反义核苷酸转染细胞的方法如下：细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640中生长到融合，弃去培养液，加入10mol·L-1用无血清培养液溶解的反义p120ctn寡核苷酸（60g/ml），无血清培养液培养1hr，然后换含10%胎牛血清继续培养24hr。3.免疫沉淀(IP)和免疫印迹(IB)：细胞用溶解液（40mMNaPO4,pH7.2,250mMNaCl,50mMNaF,[e-mail],1%TritonX-100,1%Deoxycholate）在冰上溶解20min，震荡数秒，然后在4℃下14,000rpm离心10min，上清液用Bradford法测蛋白含量（Bio-Rad），以1000g的总蛋白与10g的抗-pp120抗体进行保温，然后加入50l的蛋白G-琼脂糖混合液，4℃转动下保稳一小时，洗琼脂糖四次，然后加入50l2SDS上样buffer，煮沸5min，离心，取上清30l上样到8%SDS-PAGEgel进行电泳。把蛋白转到PVDF膜,然后膜与抗-磷酸酪氨酸单抗（(PY20)在4℃下保温过夜。与HRP标记的二抗保温，最后进行ECL发光并用X光胶片进行暴光，并在柯达自动洗片机中进行胶片冲洗。4.细胞粘附试验[11]生长达到80%融合的细胞用无血清培液培养8hr，然后分别以不同的药物处理，再给EGF处理，细胞在EDTA消化后转到用Fibronectin包被96孔培养板，每孔加入经处理的细胞悬液100μl(10000个细胞)后，置37℃，5%CO2温箱中保温4hr后取出，用温的1640培液轻轻洗去未粘附的细胞，加0.4%EDTA/PBS37℃下保温20min，解离去粘附的细胞，收集于另一培养板中，并用血球计数板计数。粘附细胞数加入细胞总数5.细胞迁移试验[12]包被10μgFn的6孔培养板待长满细胞，用200μlTip轻轻擦过孔底，划一“井”字。用PBS漂洗培养板，加入培养液继续培养24hr。显微镜下观察划痕中细胞迁移情况，并照相以图片表示。6.免疫荧光显微镜技术：在激光细胞仪下观察照相。7.细胞形态学观察：免疫细胞化学法，在Olympus荧光显微镜下观察照相。结果一、反义核酸转染细胞效果鉴定转染p120ctn反义核苷酸前后的细胞荧光图谱(图1)AB图1反义