铜离子固定金属亲和色谱在生物大分子中的应用

《化学通报》在线预览版-1-铜离子固定金属亲和色谱在生物大分子中的应用王燕李蓉*陈国亮王小刚（西北大学化工学院西安710069）摘要铜离子固定金属亲和色谱作为一种有效的分析方法，已普遍应用于生物大分子的分离与纯化。本文从理论和应用两个方面综述了近几年该领域的进展。就新型基质、螯合配体、色谱动力学、联用技术以及蛋白质分离纯化、复性等方面进行了评述。关键词铜离子固定金属亲和色谱生物大分子螯合配体色谱动力学TheApplicationofCu(II)-ImmobilizedMetalAffinityChromatographyinBiomacromoleculeWangYan,LiRong*,ChenGuoliang,WangXiaogang(CollegeofChemicalEngineering,NorthwestUniversity,Xi’an,710069)AbstractCu(II)-immobilizedmetalaffinitychromatography(Cu(II)-IMAC),asahighlyreliableanalyticalprocedure,hasbeenwidelyusedinseparationandpurificationofbiomacromolecule.TheapplicationofCu(II)-IMACinbiomacromoleculeincludingthenoveltypesofmatricesandchelatingligands,chromatographicdynamics,combinationtechniques,proteinpurificationandrefoldinghasbeenintroduced.KeywordsCu(II)-immobilizedmetalaffinitychromatography(Cu(II)-IMAC),Biomacromolecule,Chelatingligand,Chromatographicdynamics1975年，Porath等基于生物大分子与固定在基质上的Cu2+间的亲和作用进行分离，提出了铜离子固定金属亲和色谱（Cu(Ⅱ)-IMAC）的概念，以研究蛋白质、核酸、酶等生物大分子与重金属Cu2+间的作用，后来发展成一种新的分离方法。亲和作用的实质是，生物大分子中的给电子基团与能提供一个或多个配位点的电子受体Cu2+间的反应。当生物大分子，如蛋白质，与Cu2+螯合配体结合时，从Cu2+螯合配体中取代了弱结合的配位体（如H2O），被吸附的蛋白质通过质子化作用（降低溶液的pH）或加入竞争洗脱剂（如咪唑、甘氨酸、组氨酸等）而可以被洗脱。不同的蛋白质与Cu2+有着不同的亲和力，多数情况下正是利用这种差异对蛋白质进行有效的分离和纯化。对于IMAC技术在生物大分子研究领域的推广及应用，已有多篇综述论文[1～5]。Cu2+与表面含组氨酸的蛋白质强烈结合，蛋白质在Cu(Ⅱ)柱上的色谱行为较其它金属螯合柱更具有金属螯合特征。本文在总结前人工作的基础上，结合笔者近几年来的研究体会[6,7]，着重对Cu(Ⅱ)-IMAC固定相研究及其在生物大分子研究领域中的应用进行评述。陕西省自然科学基金项目(2007B22)、西北大学校基金项目（U5NW4）资助。2008-01-31收稿，2008-03-20接受《化学通报》在线预览版-2-1Cu2+螯合吸附剂的组成Cu2+螯合吸附剂是由被固定的金属Cu2+、基质和螯合配体三部分组成(图式1)。螯合配体通过共价键与基质结合形成固定相，当引入Cu2+时，螯合配体与Cu2+形成可与蛋白质发生作用的Cu2+螯合吸附剂。表1列出了常用于Cu(Ⅱ)-IMAC的商品固定相填料。表1Cu(Ⅱ)-IMAC的商用固定相填料Tab.1CommerciallyavailableresinsusedinCu(Ⅱ)-IMAC制造商商品名基质配体PE-BiosystemsPOROSMC交联聚苯乙烯/二乙烯苯亚氨基二乙酸AppliedBiosystemsPoros20MC聚苯乙烯/二乙烯苯亚氨基二乙酸IMACSepharoseHighPerformanceMediaChelatingSepharoseFastFlowHiTrapChelatingHPColumns6%高交联琼脂糖GEHealthcareSTREAMLINEChelating6%大孔高交联含晶型石英核琼脂糖亚氨基二乙酸TosoHaasTSKChelate-5PW聚甲基丙烯酸酯类亚氨基二乙酸BiaSeparationsCIMdisc甲基丙烯酸缩水甘油酯-二甲基丙烯酸乙二酯共聚物亚氨基二乙酸Bio-RadProfinityIMACUnchargedResinUNO球型基质亚氨基二乙酸NTAagarose交联琼脂糖QiagenNTASuperflow6%高交联琼脂糖氮基三乙酸Cu-PDC-SepharoseAffilandCu-PDC-6FF交联琼脂糖羧基戊二胺三乙酸PierceBiotechnologyImmobilizedIDA琼脂糖亚氨基二乙酸TosohBioscienceToypearlAF-Chelate-650M甲基丙烯酸类聚合物亚氨基二乙酸IontosorbOXIN8-羟基喹啉IontosorbIontosorbIDA纤维素微球亚氨基二乙酸图式1Cu(Ⅱ)-亚氨基二乙酸(IDA)-蛋白质配合物Scheme1CoordinationcompoundofCu()Ⅱ-Iminodiaceticacid(IDA)-Protein《化学通报》在线预览版-3-1.1固定的金属铜离子（Ⅱ）金属离子与不同蛋白质作用时，由于金属离子所带电荷、离子半径和电子层结构的不同，对蛋白质呈现出不同的亲和力。当电荷数相同时，金属离子半径越小、晶体场稳定化能(CFSE)越小，配位作用越强，与蛋白质形成的配合物越稳定。与带有相同电荷的其它过渡金属离子如Ni2+、Zn2+和Co2+相比，Cu2+半径最小，其配位化合物稳定化能最低[3]，因此，金属螯合Cu(Ⅱ)柱对蛋白质具有最强的结合力。Cu是一个具有d层空价电子轨道的过渡金属，可与配位体形成能同蛋白质结合的Cu2+螯合配体。根据Pearson软硬酸碱理论，Cu2+是交界酸，它可优先与同属交界碱的芳香族氮和软碱硫原子，如组氨酸中的咪唑基、色氨酸中的吲哚基和半胱氨酸中的巯基配位。通常蛋白质表面组氨酸数目越多，解离常数越大，配位原子中孤对电子取向与Cu2+中空价电子轨道的伸展方向越一致，蛋白质与Cu2+螯合配体就越容易成键。当蛋白表面的组氨酸(His)分布呈-His、-His（Xn）His、-His（Xn）His（n（2，3）、α-螺旋）、-HisHis-时[3,8]，半胱氨酸(Cys)的分布为Cys(XX)Cys时，均可被金属螯合Cu(Ⅱ)柱吸附[5]。1.2基质基质的作用是支撑螯合配体，它对Cu2+和蛋白质之间形成多种配合物的稳定性有很大的影响。用于Cu2+螯合色谱中的基质主要分为无机和有机基质两类。常见的无机基质为硅胶，有机基质有琼脂糖（Agarose）、交联琼脂糖（Sepharose）、交联葡聚糖（Sephadex）、大孔纤维素以及有机聚合物TSK-gelG500PW等。不同类型的基质直接影响着Cu(Ⅱ)-IMAC对生物大分子的选择性。Ren等[9]利用金属螯合Cu(Ⅱ)柱，对以IDA为配体的HiTrapChelatingHP、TSKChelate-5PW、Poros20MC和CIMdiscs等4种不同基质对组氨酸肽的选择性的研究表明，不同基质的物理、化学性质的差异直接影响着它们对组氨酸肽的亲和率。随着Cu(Ⅱ)-IMAC技术在生物大分子研究领域的不断发展，近年来，又出现了一些新的基质。McCarthy等[10]利用原子转移共聚方法在无孔聚合珠表面形成含金属的微粒，开发出了一种用于分离朊病毒肽和蛋白质的IMAC固定相，利用与蛋白-Cu结合区类似的合成肽考察了柱子的分辨力。Jain等[11]利用表氯醇交联聚合物制备出以藻蛋白酸盐为基质的固定金属螯合Cu(Ⅱ)柱，直接用来纯化山羊免疫球蛋白G(IgG)，获得了较好的蛋白回收率和纯化倍数。Bayramoğlu等[12]用甲基丙烯酸2-羟乙基酯(HEMA)和脱乙酰壳聚糖(pHEMA/Chitosan)在引发剂2,2’-偶氮二异丁腈存在下，通过紫外辐照聚合合成了互穿网络膜(IPNs)；把PBMX-5BR作为螯合染料配体共价键合到IPNs膜上，固定上Cu2+作为控制系统，研究了标准蛋白Lys在IMAC吸附剂上的结合特征，以及在水溶液中Cu2+对Lys的选择性。邱雁临等[13]用以壳聚糖为载体、Cu2+为配基的螯合亲和吸附剂分离纯化谷胱甘肽。Xi等[14]用在无孔硅胶上浸塗大孔脱乙酰壳聚糖作为IMAC吸附剂载体所制备出的Cu-CTS-SiO2来作为Cu(Ⅱ)-IMAC的基质。刘琳琳等[15]以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体，Cu()Ⅱ-IDA为金属螯合配体，定向固定了木瓜蛋白酶。骆红琴等[16]采用溶胶-凝胶法，在正庚烷乳液中制成无孔脲醛树脂-ZrO2复合微球基体，利用迈克尔加成反应通过亲核取代与螯合剂IDA键合，制成IDA-UF-ZrO2固定相,在与Cu2+螯合后,形成金属螯合亲和色谱固定相(Cu-IDA-UF-ZrO2)，考察和评价了牛血清蛋白(BSA)在此固定相上的色谱性能。1.3螯合配体螯合配体主要是用来固定Cu2+，为保证被固定的Cu2+在色谱过程中不流失以及选择性地结合蛋白质，使用的螯合配体应当满足：1)具有与间隔臂偶合的官能团；2)具有能与被固定的Cu2+强烈结合的《化学通报》在线预览版-4-OHHCu(II)OOCOCH2NHCH2HHOCOOHHOCu(II)OOCOCH2NCH2HHOCOOHHCH2COOHHCu(II)NH2NH2CH2CH2NNH2CH2CH2OHHCH2CH2OHHCu(II)OOCOCH2NHCH2CH2NCH2OOCH2COC图式2Cu(Ⅱ)-多齿配体螯合物Scheme2MultidentatechelatorsincomplexeswithCu()Ⅱ多个配位原子，并且能形成牢固的环状螯合物；3）配位原子的数目不应超过Cu2+的配位数，以保证Cu2+被固定后还剩余足够多的且能满足蛋白质分子配位的空价电子轨道；4）选择的螯合配体不应损害蛋白质的功能和酶的活性。符合上述条件的Cu2+螯合配体通常分为三大类：多齿配体、染料配体以及其它的给电子分子。根据配位原子数的不同，多齿配体又可分为单齿、二齿、三齿、四齿和五齿配体，而用于金属螯合Cu(Ⅱ)柱的配体主要为三齿（如亚氨基二乙酸，IDA）、四齿（氨基三乙酸，NTA；三氨基乙基胺，TREN）、五齿配体（N,N,N，-三羧甲基乙二胺，TED；羧基戊二胺三乙酸，PDC）。根据分子结构以及多齿螯合机理（图式2），配位原子数目越多，与被固定的Cu2+形成的螯合配体越稳定，Cu2+越不易泄漏。但当螯合配体的配位原子数等于或超过Cu2+的配位数时，中心Cu2+的配位点被完全占据，无法再与蛋白质表面的给电子原子结合。因此，选择的螯合配体既要保证能与Cu2+牢固结合，还要保证Cu2+满足蛋白质分子配位的需要。实践证明，具有3个和4个配位原子的三齿和四齿螯合配体较为适用[5]。三嗪类染料是近年来新开发的螯合配体。这一类染料如Cibacron蓝（CB）、Cibacron红（CR）、Procion褐（PB）等[17.12，18]，均可与Cu2+配位。与多齿配体相比，染料配体对Cu2+螯合配位的稳定性较差。此外，在一些条件下，染料配体对生物大分子的吸附除了与Cu2+螯合配位作用有关，还与其自身的染料亲和作用有关[16]。其它的给电子分子也可作为新的螯合配体，如在Cu(Ⅱ)-IMAC梯度洗脱过