阿卡宁衍生物合成产物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选-阿卡宁衍

中山大学化学与化学工程学院第五届(2004学年)创新化学实验报告-左娜娜128阿卡宁衍生物合成产物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选左娜娜马志玲*(中山大学化学学院分析化学研究所，广州，510275)摘要本文以合成得到的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物为研究对象，通过紫外分光光度法检测出混合物是否具有活性，进一步通过高效薄层色谱法（HPTLC）确定活性物质的个数以及位置，接着通过液相－质谱（LC-MS）联用等方法对活性物质定性分析。混合物体系，通过本实验的方法，不经分离提纯即可测定各种化合物是否具有抑制能力以及抑制活力的大小，包括各种副产物，因而可以获得合成体系中有关抑制剂的最大的信息量。关键词乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选1前言阿尔茨海默病（Alzheimer’s，AD）是一种多发生于老年人中的缓慢进行性、智能衰退性疾病，俗称老年性痴呆病。AD的关键性症状主要是由胆碱能功能障碍所引起的，治疗AD病的主要途径是寻找新的中枢拟胆碱药，乙酰胆碱酯酶抑制剂就是其中的一类治疗药物。传统的药物筛选方法是定向合成再定向筛选，即首先通过化学预试寻找到药物先导物，接下来设计合成路线，对产物进行分离纯化，最后检验活性。传统筛选方法有两个主要缺陷，一是传统活检只能应用于纯品，该方法只适用于易分离体系，对难分离混合物体系暂时没有解决办法；二是传统定向合成只关注主合成产物，无视副产物也可能会有活性等信息。而在本方法中，合成产物不需经过分离和纯化，可以直接筛选出活性物质并对其定性。本文以合成得到的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物为研究对象，通过紫外分光光度法检测出混合物是否具有活性，进一步通过高效薄层色谱法（HPTLC）确定活性物质的个数以及位置，接着通过高效液相色谱法（HPLC）以及液相－质谱（LC-MS）联用等方法对活性物质定性分析。这种筛选方法，克服了传统筛选方法的弊端，讲求整体性，对任意的合成体系，可以判断出产物是否具有活性、活性物质的位置以及活性物质的结构，这对药物筛选有重要的指导意义。基金项目：中山大学化学与化工学院第五届创新化学实验与研究基金项目资助第一作者左娜娜，女，中山大学化学与化工学院应用化学专业2001级指导老师马志玲，中山大学化学院，副教授，Email：[e-mail]中山大学化学与化学工程学院第五届(2004学年)创新化学实验报告-左娜娜1292实验部分2.1抑制剂混合物体系的合成反应步骤如下：在两个50ml圆底烧瓶中，分别加入50mg原料和5ml甲醇，搅拌溶解；分别加入2-氨基吡啶和2-氨基代苯骈噻唑50mg；室温状态下搅拌72h；用薄层色谱法监测反应的进行程度，必要时加入催化剂硼酸（催化量）；反应结束后，用氮气把溶剂吹干，再用三氯甲烷溶解；转入分液漏斗中，用水洗两次，每次5ml。合并提取液，用无水硫酸钠干燥；把干燥后的反应液用氮气把溶剂吹干，用2.5ml甲醇溶解。密封，冷冻保存，备用。2.2乙酰胆碱酯酶抑制剂的活力测定（IC50的测定）分别吸取一定量的抑制剂溶液（1mg/ml），20μlL4mg/ml的DTNB溶液，5μL0.1mg/ml乙酰胆碱酯酶溶液和pH＝8.0磷酸盐缓冲溶液，置于酶反应管中，于37℃下恒温30分钟，加入20μL2mg/ml氯化乙酰胆碱，迅速混和均匀后，倒入500μL的比色皿，测试λ=432nm处的吸光度，记录吸光度随反应时间的变化。以抑制剂溶液的浓度为横坐标，乙酰胆碱酯酶活力（OD432）为纵坐标作图。2.3薄层色谱法筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂2.3.1分离乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物将抑制剂混合物配成1mg/ml的甲醇溶液，吸取2µL在2.5×10cm的薄层板上进行点板，然后在下列展开剂体系中展开。三氯甲烷：石油醚：乙酸乙酯＝1.0：2.9：1.1；0.4ml的0.1mol/L的HCl甲醇溶液；流动相走过的距离为8.0cm。2.3.2鉴别具有抑制能力的化合物乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶存在的条件下发生的水解反应如下：Acetylthiocholine+H2O→acetate+thiocholineThiocholine+DTNB→2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine+5-thio-2-nitrobenzoate(yellow）将抑制剂混合物配成1mg/ml的甲醇溶液，取2µL在2.5×10cm硅胶板上进行点板，然后在2.3.1中的展开剂体系中展开，逐次喷上2mg/ml的氯化乙酰胆碱和4mg/ml的DTNB溶液，使得整块硅胶板被饱和而其上的样品斑点不至于脱落。自然放置5min，使硅胶板晾干。最后喷上0.1mg/ml的酶溶液。大概5min后可以看到硅胶板黄色背景上出现白色圆圈，中山大学化学与化学工程学院第五届(2004学年)创新化学实验报告-左娜娜130该现象应在15min内观察记录，20-30min内会自然消失。2.4液相－质谱联用法测定各种抑制剂化合物的分子量及分子结构将抑制剂样品配成1mmol/L的甲醇溶液，经高速离心机离心后，吸取上层清液进样，在下列色谱条件下进行测定。色谱柱：Thermo150mm×2.1mm3um；毛细管温度：270℃；喷射电压：24.08V；辅气：鞘气；进样量：10μL；流动相：甲醇、1％的甲酸3结果与讨论3.1.乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物抑制活力的测定（1）2-氨基吡啶合成的抑制剂混合物的IC50的测定051015200.00150.00200.00250.00300.0035OD432抑制剂用量/μg图一2-氨基吡啶合成的抑制剂混合物的IC50测定结果结论：2-氨基吡啶抑制剂混合物的IC50值为8.5µg，换算成体系中的浓度为2.8µg/ml。（2）2-氨基苯并噻唑合成的抑制剂混合物的IC50测定051015200.00100.00150.00200.00250.00300.0035OD432抑制剂用量/μg图二2-氨基苯并噻唑合成抑制剂混合物的IC50测定中山大学化学与化学工程学院第五届(2004学年)创新化学实验报告-左娜娜131结论：2-氨基苯并噻唑抑制剂混合物的IC50值为16.27µg，换算成体系中的浓度为5.43µg/ml。3.2高效液相色谱分离混合物并测定其各自的相对含量经过对一系列梯度进行条件实验,综合考虑出峰时间、峰形和分离度，得出如下梯度下分离效果最佳：0～5min80%～85%、5～15min85%～95%、15～20min95%～100%。（1）2-氨基吡啶合成的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物min0246810121416mAU-8-6-4-20DAD1B,Sig=500,8Ref=600,100(ZNN\050519\05051902.D)2.0452.7165.90713.10214.04415.05715.658图三2-氨基吡啶合成抑制剂混合物经HPLC分离的色谱图（2）2-氨基苯并噻唑合成的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物min051015202530mAU-8-6-4-202DAD1B,Sig=500,8Ref=600,100(ZNN\050519\05051905.D)2.1472.30412.64813.25119.70120.13120.50520.935图四2-氨基苯并噻唑合成的抑制剂混合物经HPLC分离的色谱图结论：由图可知，两个抑制剂混合物体系中各个的物质都得到了较好的分离。3.3薄层色谱法初步筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂3.3.1最佳展开剂体系的确定在实验过程中，分别对100%的石油醚、100%的氯仿、100%的苯等单相展开剂体系，不同物质组成的两相展开剂体系，不同比例的石油醚与乙酸乙酯等两相展开剂体系，以及在石油醚与乙酸乙酯体系中，加入了盐酸的甲醇溶液和三乙胺的甲醇溶液的多相展开剂体系作了比较，考察了其对分离的影响。本实验选择的石油醚：乙酸乙酯＝7.75：2.25（1.45：0.55）。在两相体系的选择过程中，发现氯仿体系对混合物体系的分离也有较好的结果，因此对比石油醚/乙酸乙酯两相体系和石油醚/乙酸乙酯/氯仿三相体系，实验结果表明氯仿的加入对分离有好的影响。固定石油醚和乙酸乙酯两组分含量的基础上，改变氯仿的量，从而确定中山大学化学与化学工程学院第五届(2004学年)创新化学实验报告-左娜娜132氯仿的最佳加入量。最终确定展开剂体系中各租大风含量比为：三氯甲烷：石油醚：乙酸乙酯＝1.0：2.9：1.1。通过进一步的实验，发现加入了盐酸的甲醇溶液后，比移值会有进一步改善。分离该抑制剂混合物的最佳的盐酸的量为0.4mL。3.3.2薄层色谱法鉴别具有抑制活力的化合物氯化乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶存在条件下，水解生成acetate和thiocholine，thiocholine和显色剂DTNB反应生成黄色物质5-thio-2-nitrobenzoate，所以待样品溶液用薄层色谱法分离，再逐次喷上底物、显色剂以及新鲜的酶液后，整个硅胶板呈现黄色背景。而在有抑制剂化合物存在的地方，由于抑制剂抑制了底物的水解，则呈现白色。所以，硅胶板上的白点即代表着具有抑制能力的化合物。利用上述现象，本实验可以粗略用薄层色谱法来筛选出具有乙酰胆碱酯酶抑制剂的化合物。3.4液相－质谱法分别测定各种抑制化合物的分子量及确定其分子结构通过液质联用技术，得到了该抑制剂混合物体系的液相色谱图和质谱图。对于各个不同保留时间的物质，同时也分析了其各自的质谱图，从而得到了其各自的分子量。为了得到各种物质的分子结构，还分析了其各自的二级质谱，实验结果见下类图。以2-氨基吡啶为例说明：pyridine#317RT:12.09AV:1NL:2.60E5T:-cESIFullms[150.00-1500.00]150200250300350400450500550600650700750800850900wavelength(nm)020000400006000080000100000120000140000160000180000200000220000240000Intensity461.20361.25483.05405.32777.09406.39583.09565.14745.87706.42822.71393.26496.59643.01584.21438.62562.46869.96333.16697.77730.69788.27542.87322.86271.11183.24249.05图八保留时间t＝12.09min时物质所对应的质谱图中山大学化学与化学工程学院第五届(2004学年)创新化学实验报告-左娜娜133pyridine#323RT:12.32AV:1NL:2.81E5T:-cESIFullms[150.00-1500.00]150200250300350400450500550600650700750800850900wavelength(nm)020000400006000080000100000120000140000160000180000200000220000240000260000280000Intensity361.21463.16461.11877.18464.23844.91692.83497.06363.29405.63545.02809.28662.98589.51744.89383.06879.20343.32422.59641.09506.76710.70323.26895.55272.99183.36241.06图九保留时间tr＝12.32min时物质所对应的质谱图pyridine#327RT:12.47AV:1SB:711.79-12.25NL:5.54E5T:-cESIFullms[150.00-1500.00]150200250300350400450500550600650700750800850900m/z050000100000150000200000250000300000350000400000450000500000550000Intensity463.2464.3361.2485.1848.