非无菌产品微生物检查：控制菌检查法

/131非无菌产品微生物检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物的无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。培养基适用性检查和方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC（B）26003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC（B）10104〕大肠埃希菌(Escherichiacoli)〔CMCC（B）44102〕乙型副伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiB)〔CMCC（B）50094〕白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC（F）98001〕/132生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨肉汤培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖肉汤培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时。上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应以稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。培养基适用性检查控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。各培养基的检测项目及所用的菌株见表1。表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌肉汤促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力+指示特性大肠埃希菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂促生长能力+指示大肠埃希菌/133特性沙门菌RV沙门菌增菌肉汤促生长能力乙型副伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力+指示特性乙型副伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂促生长能力+指示特性金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示特性白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查取试验菌悬液（见表1）各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对应的对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌/134应不得生长。培养基指示特性检查取试验菌悬液（见表1）各0.1ml（含菌数不大于100cfu）分别涂布于被检培养基和对应的对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。方法适用性试验供试液制备按下列“供试品检查”中的规定制备供试液。试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。适用性试验按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性（见非无菌产品微生物检查：微生物计数法（附录×××）中的“抗菌活性的去除或灭活”），并重新进行方法适用性试验。如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。供试品检查供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。阳性对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。耐胆盐革兰阴性菌(Bile-TolerantGram-NegativeBacteria)供试液制备和预培养取供试品，用胰酪大豆胨肉汤作为稀释剂照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”（附录×××）制成1：10供试液，混匀，/135在20～25℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（一般2～5小时）。未检出试验除另有规定外，取相当于1g或1mL供试品的上述预培养物接种至肠道菌增菌肉汤中，30～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。定量试验选择和分离培养取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1mL、0.01mL和0.001mL）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌增菌肉汤中，30～35℃培养24～48小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24小时。结果判断若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表2查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的最大可能数。表2耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数各供试品量的检查结果每1g(或1mL)供试品中可能的菌数（N）0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml＋＋＋N＞103＋＋－102＜N＜103＋－－10＜N＜102－－－N＜10注：⑴＋代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；－代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。⑵若供试品量减少10倍（如0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），那每1g(或1mL)供试品中可能的菌数（N）应相应增加10倍。大肠埃希菌(Escherichiacoli)供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数/136法”（附录×××）制成1：10供试液。取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨肉汤中，混匀，30～35℃培养18～24小时。选择和分离培养取上述预培养物1mL接种至100mL麦康凯肉汤中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，30～35℃培养18～72小时。结果判断若麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验,确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。沙门菌（Salmonella）供试液制备和增菌培养取10g或10mL供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨肉汤中，混匀，30～35℃培养18～24小时。选择和分离培养取上述预培养物0.1mL接种至10mLRVS增菌肉汤中，30～35℃培养18～24小时。取少量RV沙门菌增菌肉汤培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，30～35℃培养18～48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上生长良好，菌落为红色、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层有黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验,确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”（附录×××）制成1：10供试液。取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨肉汤中，混匀。30～35℃培养18～24小时。/137选择和分离培养取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，30～35℃培养18～72小时。取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步鉴定。氧化酶试验将洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。结果判断若溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验,确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”（附录×××）制成1：10供试液。取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨肉汤中，混匀。30～35℃培养18～24小时。选择和分离培养取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，30～35℃培养18～72小时。结果判断若甘露醇氯化钠琼脂平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验,确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。梭菌（Clostridia）供试液制备和热处理取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”（附录×××）制成1