项目名称：生物医学纳米材料对血细胞作用的研究首席科学家：

项目名称：生物医学纳米材料对血细胞作用的研究首席科学家：顾宁东南大学苏州研究院起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部江苏省科技厅二、预期目标总体目标：本项目以血液恶性肿瘤的早期诊断、有效治疗和疗效评价的重大临床需求为目标，通过研究纳米材料对血细胞的作用，将纳米生物医学技术与血液恶性肿瘤诊治相结合，力争在血液恶性肿瘤的发病机制和病理学研究、早期检测与诊断、临床干预与治疗方面取得具有重大国际影响力的原创性重要成果，建立和发展全新的血液恶性肿瘤诊治策略和方法，培养能够进行原创性研究的交叉学科人才，使我国在生物医学纳米材料及其在血液恶性肿瘤诊治的应用研究这一领域进入国际先进行列，为人类健康事业做出贡献。五年预期目标：通过五年的努力，实现以下目标：1．基于纳米材料对白血病细胞的作用，发展有效的纳米基因载体，在白血病细胞中得到转基因的高表达；明确若干白血病致病基因；2．研制出具有特异性生物识别和示踪功能的光学、磁学及电化学生物纳米探针及其标记白血病细胞的方法；阐明中枢神经系统白血病形成机制的一般规律，以及白血病细胞穿越血脑屏障的调节分子。为白血病的诊治提供实验和理论基础。3．揭示纳米探针对血液细胞的生物学作用，建立和完善血液细胞实时动态监测的技术平台；构建血液恶性肿瘤快速和分型诊断的微芯片纳米技术平台。4．建立纳米探针与显微医学影像创新科技平台；研制出纳米材料标准样品和具有自主知识产权的高性能纳米探针，建立高特异、高灵敏、高分辨、动态实时的血液恶性肿瘤分子影像学诊断与疗效评价新方法。5．阐明纳米粒子对血液中免疫功能细胞的作用机理、调控免疫效应的信号传导通路和机制；6．确立1～3种提升抗白血病免疫反应的纳米材料，建立相关应用技术流程和方法，建立针对T淋巴细胞性白血病的纳米免疫治疗方法。通过上述目标的实现，促进我国纳米生物医学与生物医学工程等学科的发展，在交叉学科的前沿基础研究方面做出独创性成果。发表135篇左右具有高影响力的研究论文，申请20个左右相关发明专利，为我国的纳米生物医学领域培养一批科研人才，培养研究生80～100名，博士后8～12名。进一步发展和壮大科研团队，培养和稳定一支创新、合作、结构合理、特色鲜明的高层次研究队伍。三、研究方案一、在纳米材料与白细胞的作用及其在白血病发病机制和病理学的研究方面，重点围绕中枢神经系统白血病形成机理和急性髓系白血病相关基因的筛选和致病机理来进行。具体路线如下：1.优化针对血液细胞的基于纳米材料/技术的基因递送方法1.1选择不同的纳米材料（如无机碳酸磷灰石纳米颗粒、磁性纳米颗粒，或进行一定的表面修饰）搭载报告基因（比如GFP）转染不同的细胞以确定适合各种细胞的纳米材料；改变转染中的各种条件（包括含有GFP的DNA片段的长度，纳米材料与DNA片段的比例等）以优化转染方法；使用流式细胞仪检测GFP+的细胞以确定转染的效率，以及基因表达的时间和强度等。1.2选购或构建shRNA及cDNA文库和合适的纳米材料，建立使用纳米材料递送基因文库的实验基础。2.应用纳米材料/技术进行白血病相关基因的功能鉴定及机制研究2.1进行白血病相关基因的功能鉴定及机制研究针对G蛋白耦联受体（GPCR）家族成员、Bcl11a、融合基因FUS-ERG和慢性粒细胞白血病与正常造血干/祖细胞间存在的表达差异基因（由转录组数据提示），选择适当的体外细胞模型使用已优化的基因递送方式转染细胞后，进行细胞增殖、细胞周期/凋亡和集落生成等多种检测以鉴定其功能。并选择其中的一些基因研究它们对某些白血病细胞在小鼠中致白血病或皮下成瘤能力的影响，必要时建立适当的转基因动物模型进行研究。针对Bcl11a、FUS-ERG和本研究中新鉴定到的功能基因还将进行基因稳定表达、基因沉默和基因组学（microarray、array-CGH和ChIP-on-chip等）等多种机制学研究，以鉴定它们发挥作用的细胞内信号网络，并探讨它们作为新的治疗靶点的可行性。针对Bcl11a和本研究中新鉴定到的功能基因也将进行临床研究，以探讨它们作为人类白血病预后指标的临床价值。2.2鉴定调控正常和白血病干细胞功能的基因：用流式细胞术分离表型为Lin-/Sca-1+/C-kit+的正常造血干细胞，或CD34+/CD38-或CD96+的急性髓系白血病干细胞，采用上述1中优化的纳米材料搭载shRNA寡核苷酸文库递送入分离的干细胞，经体外培养或移植到受体鼠内，鉴定不依赖细胞因子且快速生长的干细胞克隆、或抗凋亡的干细胞克隆。对于这些克隆中受到表达抑制的基因，使用不同于文库中的shRNA进行验证（包括制备相应的转基因小鼠）。2.3应用纳米材料鉴定白血病细胞中特异表达的E3泛素连接酶利用已优化的纳米材料载体搭载泛素连接酶E3文库，并递送到可稳定表达转录因子c-maf和检测c-maf转录活性的荧光素酶报告基因的NIH3T3细胞，依据荧光素酶活性强弱，初步筛选出参与c-maf泛素化降解的特异性泛素连接酶E3，其后使用多种生物化学的实验方法加以确证。用RQ-RT-PCR方法分析E3在血液病细胞中的表达水平，以探讨它的临床预后价值；在血液病细胞中过表达E3后观察细胞增殖的变化以评估它的临床治疗价值。同时利用点突变和定向突变的方法构建不同突变体深入分析其生物学功能。3.探讨应用纳米技术标记细胞的新方法研究中枢神经系统白血病(CNSL)3.1纳米颗粒体外标记白血病细胞及MRI成像用不同浓度的纳米颗粒标记SHI-1等白血病细胞，检测白血病细胞的生长增殖及凋亡、形态等情况的变化，应用MRI成像技术观察标记效率，掌握最佳标记浓度及效果。3.2纳米示踪技术体内示踪白血病细胞的转移浸润用具有高侵袭力的SHI-1细胞系建立中枢神经系统白血病小鼠模型，将纳米示踪剂标记的SHI细胞尾静脉接种于SCID小鼠，通过MRI等成像技术体内动态观察白血病细胞的浸润转移情况及转移方式，探讨其髓外转移浸润的相关机制，如对血脑屏障各层的破坏情况等。3.3建立体外血脑屏障模型，观察白血病细胞对血脑屏障尤其是紧密连接蛋白等的破坏。利用人脑微血管内皮细胞及Matrigel胶及transwell系统模拟建立体外血脑屏障模型，观察纳米标记的白血病细胞对基底膜及紧密连接蛋白的破坏情况。二、在发展生物医用纳米探针与血细胞相互作用研究的原位、实时、动态新技术与新方法方面，学术思路是充分发挥学科集成与交叉优势，基于化学及分子生物学原理，从纳米探针设计、合成、组装和标记出发，构建具有特异性生物识别功能的纳米探针，研究各类探针的生物效应，寻找生物医学探针设计的基本规律。利用所构建的生物医学探针，建立血液细胞实时动态监测的新技术和新方法，开展活体生命过程的实时、动态研究。具体路线如下：1.生物纳米探针的构建和生物效应研究合成具有重要生物应用前景的纳米贵金属、磁性纳米材料、核壳结构纳米半导体材料（量子点）、树枝状大分子材料，通过自组装、层层组装、包埋、化学偶连等方法对这些纳米材料进行功能化修饰，使之具有良好的生物相容性和特异性识别血液细胞表面受体或细胞内特异性蛋白表达的功能。将生物纳米探针与血细胞共孵育，采用扫描探针显微（SPM）、激光扫描荧光共聚焦显微等方法，结合磁共振波谱及细胞生物学方法，研究所构建的纳米探针对细胞膜作用、跨膜转运机制和动力学，跟踪并记录生物纳米探针所引起的血细胞的DNA损伤、线粒体膜电位变化、Caspase酶激活等生理变化，以获取血细胞内多种反应的动态化学信息、电化学信息及反映整体的功能状态。2．利用纳米探针特殊的光电化学性质，研究针对血液恶性肿瘤的特异基因及致病相关基因、蛋白质（如慢性髓系白血病(CML)的bcr/abl基因、融合蛋白P210等）的超微量、快速、高灵敏的检测新方法。3．设计特殊结构的通道，将各种微阀微泵微反应室等集成在芯片上，实现单细胞或群体细胞的操纵、分选、及实时监测，建立细胞与纳米粒子相互作用研究的功能化、集成化、自动化微流控芯片平台；基于细胞图案化研究技术，利用细胞特异性识别的蛋白如抗体、适配体等，实现稀少细胞的筛选、富集，搭建集细胞捕获、培养、受激和响应为一体的在线原位细胞信号的检测平台。基于微流控芯片平台，利用纳米探针监控药物对血细胞的增殖、凋亡的影响，实现可寻址、实时、在线的高通量药物筛选研究。4．以HL-60细胞、K562细胞等白血病细胞为模型，采用电化学、电化学发光方法、荧光、生物质谱以及简单便捷的可视化检测模式，研究纳米探针的跨膜机制，与细胞表面及胞内组分作用的动态过程，并对细胞的凋亡进行原位诱导与检测，开展恶性血液病诊断和预后评估的基础性研究。三、在研究纳米材料对恶性淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞的作用和体内检测与诊断方法方面，重点发展多模式、多靶点分子影像新理论和新方法。具体路线如下：1.采用热分解法制备磁共振成像用高性能磁性纳米粒子，实现稳定的控制制备工艺，建立纳米氧化铁国家标准样品及MRI弛豫率标准定值方法。采用化学偶联技术将白血病、恶性淋巴瘤和骨髓瘤探针分子连接到磁性纳米粒子上，制备用于血液恶性肿瘤体内外检测的磁性纳米粒子诊断制剂和医学影像纳米探针。利用冷冻干燥技术将磁性纳米探针制成冻干粉制剂，研究其稳定性、再分散性、生物相容性、MRI弛豫特性以及偶联方法对抗体活性的影响。2.采用胶体化学方法研制新型金属纳米粒子CT造影剂或纳米探针，在进一步完善自主研制的Micro-CT的基础上，用于细胞/多细胞成像的研究以及进行CT功能影像研究；采用纳米复合技术，研制结合磁性纳米颗粒的微气泡，用于磁共振-超声联合造影，研制磁性－荧光双模探针用于磁共振－光学联合影像研究，研制多模式联合成像及图像融合分析技术的研究。3.建立淋巴瘤、骨髓瘤等血液恶性肿瘤小鼠模型，结合Micro-MRI、Micro-CT和小动物光学或超声成像系统以及交流磁极化率测量系统，研究上述纳米探针特性及进入血液循环系统后的表面重构、自组装等对其生物分布和对靶器官（靶细胞）作用的影响；研究探针靶向性行为的尺寸、表面和聚集依赖性以及相关信号放大机制。4.基于磁性纳米探针的的模拟酶特性，借助外加磁场及催化显色反应，实现对循环血管内皮细胞（CEC）和循环肿瘤细胞（CTC）及相关标志物的捕获、磁分离和定量检测，进行特定肿瘤的临床诊断和预后。四、在研究纳米材料对血液免疫功能细胞的作用和白血病纳米免疫治疗方面，主要围绕纳米材料对树突细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞的作用展开。通过深入探究纳米材料及其与白血病相关抗原的结合体对上述免疫细胞功能的作用，在考虑和评价纳米材料血液相容性的基础上，发展和建立白血病纳米免疫治疗技术和方法。具体路线如下：1.纳米粒子表面功能化及免疫学效应研究采用化学修饰方法对纳米粒子表面分别做不同程度的氨基化、羧基化、PEG化修饰，调整和改变纳米粒子的物理化学性质。在细胞株模型上，分别采用细胞活性检测、流式细胞分析、激光共聚焦、蛋白芯片、ELISA、westernblot等方法和技术手段研究上述纳米粒子对淋巴细胞杀伤功能的影响，对巨噬细胞和树突细胞吞噬能力及产生细胞因子的组成和水平的影响。2．纳米材料对巨噬细胞作用研究从白血病细胞系K562中提取白血病裂解抗原；从国外购入或获取白血病免疫治疗相关抗原，包括BCR-ABL,PML,PRTN3等。通过化学连接、物理吸附等方式将肿瘤抗原与纳米材料相结合，制备纳米材料与肿瘤抗原的复合物。分别选择巨噬细胞株、血液中巨噬细胞为模型，采用蛋白芯片、ELISA、westernblot等方法和技术手段研究上述纳米粒子和肿瘤抗原复合物诱导巨噬细胞分泌细胞因子谱的变化；采用细胞活性检测、流式细胞分析、激光共聚焦等方法研究巨噬细胞向不同功能的转化以及纳米材料对巨噬细胞亚型相互转化的阻遏作用。3.纳米粒子对DC细胞的作用研究方案分离外周血单个核细胞，从中诱导培养出树突状细胞。采用化学诱导方法刺激原始树突细胞，与纳米材料或纳米材料与肿瘤抗原的复合物共孵育，将树突细胞和新鲜分离的外周血单个核细胞混合，利用细胞活性检测技术（MTS/ELISA）检测DC细胞诱导淋巴细胞抗肿瘤反应能力混合后的细胞对特定肿