食品微生物检测基础培训教材

食品微生物检测基础食品微生物简介１微生物的概念２微生物包括的种类３病原微生物的概念４微生物的特性５细菌的基本形态和结构微生物的定义：是一群形体细小、结构简单、人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物。微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、螺旋菌、立克次氏体、衣原体、病毒及微藻类等。病原微生物定义：大部分微生物是有益的，只有小部分微生物是有害的，可以引起各种疫病，这部分微生物叫做病原微生物．微生物的特性1个体微小，结构简单2分布广，种类多3繁殖快，数量大4易于变异，适应力强5易于培养，代谢活力强细菌的基本形态和结构１细菌是一种具有细胞壁的单细胞生物.２细菌的大小以微米（μm）为测量单位（一微米等于千分之一毫米）。３根据细菌形态一般分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。４细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、核糖体和内含物等基本结构。５细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。食品微生物检测所涉及的类群微生物非细胞生物细胞生物病毒原核生物真核生物细菌酵母菌、霉菌微生物检测程序样品的采集注意：1所用接触样品的用具经过灭菌2取样要均匀、特殊样品要控制温度3样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、来源、数量、采样人、地点及时间）样品的微生物检验注意：1采好的样品送检不要超过3小时2检完的样品的存放时间3报告的填写菌落总数的测定首先要明白菌落的定义。菌落的定义：将细菌划线接种在固体培养基上经18∽24小时培养，长出肉眼可见的有单一细菌生长繁殖而成的细菌集团。菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1ml（g）检样中所含菌落的总数。1、设备和材料：（见书151页）2、培养基和试剂：营养琼脂75％乙醇稀释剂：0.85％生理盐水菌落总数的检验程序25g(ml)样品+225ml生理盐水(1:10的稀释液)作几个适当倍数的稀释液(例如1:100，1:1000)选择2~3个适宜稀释度各取1ml分别加入灭菌培养皿中每个平皿中加适量（15~20ml）营养琼脂菌落记数（二）菌落计数方法做平板菌落计数，用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，记下各平板菌落数后，求出同稀释度的各个平板平均菌落数。（三）菌落计数的报告1、平板菌落数的选择选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数。2、稀释度的选择（见下表）例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数（个/g或个ml）报告方式（个/g或ml）10-110-210-31多不可计16420—1640016000或1.6×1042多不可计295461.63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313—313000310000或3.0×105527115—270270或2.7×1026000—110107多不可计30512—3050031000或3.1×104三、菌落数的报告1、菌落数在100以内的按其实有数报告。2、菌落数大于100的采用两位有效数字，有效数字后面的数值采用四舍五入计算。3、结果也可以用10的指数表示。注意事项：1操作要在无菌的状态下进行。2操作时间越短越好。3样品不同选择的稀释倍数不同。4培养基冷却温度不宜过高或过低。霉菌和酵母菌的计数1、设备和材料：（同细菌总数测定）2、培养基和试剂：孟加拉红培养基灭菌蒸馏水霉菌和酵母菌的检测程序25g(ml)样品+225ml无菌水作几个适当倍数的稀释液选择3个适宜稀释度，各以1ml的量加入灭菌平皿内每个平皿内加入适量培养液约20ml左右菌落计数菌落计数及报告：1、选择菌落数在10~150之间的平板进行菌落计数。2、其他同菌落总数一样。注意事项：1、培养温度是在25℃~28℃，培养时间是5天。2、在往平皿中加培养基时应多加一些。（当培养基自然漫过平皿底部时再多加一点）大肠菌群的测定一、大肠菌群MPN的概念及意义大肠菌群系指一群在37℃24小时能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以次作为粪便指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。培养基和试剂：乳糖胆盐发酵管伊红美蓝琼脂平板乳糖发酵管0.85％生理盐水革兰氏染色液大肠菌群的检验程序：注意事项：1.乳糖胆盐发酵管和乳糖发酵管在灭菌以后要检查小导管内有无气泡,如果有气泡就不能再用了。2.计算产气管的数量时以乳糖发酵管产气管的数量为准。3.从伊红美蓝琼脂平板上挑细菌接种乳糖发酵管和进行革兰氏染色时一定要挑取典型菌落，无典型菌落时要多挑几个菌落。实验室生物安全基本知识微生物实验室玻璃器皿的准备一、洗涤载玻片和盖玻片在清洗前可先在2%盐酸溶液中浸泡1h。二、灭菌前的准备制作棉塞包扎器皿灭菌微生物培养基的制备培养基的定义：是根据细菌的生长需要人工配置的营养环境。按物理性状分类可分为液体、半固体、固体培养基。按用途分类可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基。称出一定量粉状培养基→加适量的水溶解→分装→灭菌→检定→保存消毒与灭菌一、干热灭菌法1.火焰灭菌（酒精灯）2.干热灭菌（电热干燥箱）二、湿热灭菌法1.煮沸消毒2.流通蒸汽灭菌3.巴氏消毒4.加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅）消毒灭菌的基本概念1.灭菌：杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽胞的方法。2.消毒：杀死病原微生物的方法。3.防腐：防止或阻止微生物生长繁殖的方法。4.无菌：不含有活的微生物的意思。5.无菌技术（无菌操作）：防止微生物进入机体或物体的方法。显微镜的构造A、机械部分：显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。机械装置的作用是固定及调节光学镜头，固定与移动标本等。只有良好的机械装置，显微镜才能充分发挥作用。显微镜的机械装置由各种精密零件组成。（1）镜座：它是显微镜的底座，一般为马蹄形，作用是支撑整个显微镜。有的显微镜座内装有照明光源和反射镜。（2）镜柱：联系于镜座和镜臂之间，有支持显微镜其他部分的作用。（3）镜臂：一般为弯柄形，拿取显微镜时握此臂。镜臂与镜柱之间有关节相连，可以作适当的倾斜，以便观察。有些显微镜的镜臂与镜柱之间没有关系，不能做任何角度的倾斜。镜臂有持镜筒、镜台、照明装置及调节焦距装置等作用。（4）调节器：为了得到清晰的物象，必须调节物镜和标本之间的距离，使它与物镜的工作距离相等。这种操作叫做调焦。在镜臂上方（各镜位置不一样，有的一个在上方，一个在下方），有大小两种螺旋，一般向前方转动时，镜筒下降，向后方转动时镜筒上升；但也有显微镜，转动时镜柱下降；也有些显微镜在转动螺旋时，镜筒不变，而镜台上下升降。。大螺旋（粗调节）可使镜筒作较大距离和较快速度的上升或下降，通常在使用低倍镜时，用大螺旋调节，能迅速找到物景。小螺旋（细调节）可使镜筒缓慢地上升或下降，可以作精细的调节，使物象更加清晰。此外，在镜柱附近还有一个聚光镜螺旋，可以使聚光镜上升或下降（5）镜筒：镜筒是由金属制成的圆筒，上端放置目镜，下端连接物镜。镜筒内壁，为了避免光线的乱反射，喷上黑色无光漆。筒长度一般为155~250毫米，常用的为160或170毫米。国产显微镜通常是160毫米。（6）物镜转换器（回转盘）：固定在镜筒下端。它有3~4个物镜螺旋口，呈盘状。根据需要放大倍数不同，可调换不同放大倍数的物镜镜头。（7）载物台：也叫工作台或镜台。它的作用是安放载玻片。载物台中心有一个通光孔，通光孔后方左右侧各有一个安装片夹用的小孔。载物台由上下两片组成，上面一片装有旋钮，可向左右移动；下面一片通过旋钮可使上面一片前后移动。载物台的纵横坐标都装有游标尺，既能固定标本，又能使之前后移动，以便寻找物象。B、光学部分：（1）目镜：因为它靠近观察者的眼睛，因此也叫接目镜。目镜安装在镜筒的上端。各种目镜的口径尺寸都是统一的，根据需要可以互换使用。目镜只起放大的作用，并不增强显微镜的分辨力。一般有2~4个，放大功率各不相同。镜的圆筒上面刻有放大率，如5×、7×、10×、15×等符号可以区别。数字越大，放大率越高，使用时可根据需要。（2）物镜：因为它靠近被观察的物体（标本），因此也叫接物镜。许多使用者在口语上把物镜和目镜都通俗地叫做镜头。物镜安装在镜筒的下端，它的作用是将标本第一次放大，然后再由目镜将第一次放大的象做第二次放大。物镜是决定显微镜性能的最重要部位，一般有2~4个，放大率也各不相同。镜的圆筒上面有放大率如4×或10×（低倍镜）、45×（高倍境）、100×（油镜）等符号。有些显微镜的物镜上还刻有镜口率，如0.3、0.5、1.25等符号，这些符号的数字越大，放大率越高。一般计算显微镜的放大倍数是：目镜的放大率×物镜的放大率＝显微镜的放大倍数。例如，目镜的放大率为10，物镜的放大率为45，这时显微镜的放大倍数为450。（3）聚光器：是由一片或数片透镜组成。其作用相当于凸透镜，起聚光线作用。装在镜台下面，这样就能增强标本的照明，同时能使光线射入整个物镜镜口角。为了充分发挥显微镜的性能，在使用时聚光镜和物镜两者的数值孔径应相一致。在使用高倍境时，必须配以聚光镜，并且要求聚光镜和物镜口率一致，效果最好。聚光镜的镜口率可用光圈来调节，有些显微镜的光圈上刻有口径的记号。使用某种高倍境时，只有对准相应刻度即可。（4）光圈：也叫可变光圈，位于聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，中心部分形成圆孔。推动光圈的把手，可以随意调节圆孔的大小，有的光圈的边框上还刻有标明圆孔直径的尺寸。（5）反光镜：反光镜通常一面是平面镜，另一面是凹面镜，装在聚光镜下面的镜座上，可以水平与垂直两个方向任意旋转。反光镜的作用是使光源发出的光线或天然光射向聚光器。在自然光线下，常用平面镜；在室内日光灯下，常用凹面镜。革兰氏染色第一步：制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径为1厘米的薄层。若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。第二步：自然干燥第三步：固定手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次，共约2-3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。第四步：染色1.初染（结晶紫）2-3滴一分钟然后水洗。2.媒染（碘液）2-3滴一分钟然后水洗。3.脱色（95%酒精）2-3滴一分钟然后水洗。4.复染（沙黄复染液）2-3滴一分钟然后水洗。第五步：干燥第六步：镜检革兰氏阳性菌被染成紫色，革兰氏阴性菌被染成红色。练习题1、高压蒸汽灭菌时，当压力达15磅，温度121℃时，维持时间()。A、10分钟B、20分钟C、30分钟D、25分钟2、在革兰氏染色时草酸铵结晶紫滴加在已固定的涂片上染色，一般染()，用水洗去。A、半分钟B、1分钟C、1.5分钟D、2分钟3、鞭毛是细菌的()器官。A、捕食B、呼吸C、性D、运动4、真菌繁殖的主要特征是（）。A、隔壁B、孢子C、细胞壁结构D、营养类型5、球菌在一个平面上连续分裂后，连成三个或三个以上的或长或短的链状，这种细菌称（）A、葡萄球菌B、双球菌C、链球菌D、四联球菌6、细菌的君体繁殖过程可分为四期，其中细菌体积增大，代谢活跃，但细胞分裂缓慢，此阶段称（）。A、迟缓期B、对数生长期C、稳定期D、哀退期7、固体培养基理想的凝固剂是（）。A、琼脂B、明胶C、血清D、海藻酸钠8、杀死物体中病原微生物的方法，叫（）。A、消毒B、无菌C、防腐D、抑菌9、对微生物影响的物理因素包括（）。A、温度、干燥B、干燥、渗透压C、温度、辐射D、B+C10、VP试验阳性，呈（）色。A、红B、绿C、黄D、褐11、革兰氏染色液的第一液是（）。A、碘液B、结晶紫C、95％乙醇D、石碳酸复红12、载玻片和盖玻片在清洗前可先在（）溶洗中浸泡1h。A、2％的盐酸B、8％盐酸C、2％的NaOHD、6％NaOH13．饮料作沙门氏菌