高中生物竞赛辅导课件—DNA复制1

复制概况复制体系复制的起始、延伸与终止其他原核生物的复制体系其他形式的复制真核生物的复制过程DNA复制本讲内容提纲1DNA复制的基本机理－半保留复制2DNA复制的起点、方向和方式3DNA聚合酶和DNA聚合反应4复制的基本过程5DNA复制的半不连续性第一组：复制概况1、DNA复制的基本机理－半保留复制半保留复制：DNA在复制时，以亲代DNA的每一条链作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一条亲代DNA链。全保留复制半保留复制混合复制•DNA半保留复制的实验依据：•1958年Meselson&StahlE.coli放射性同位素（15N）标记CsCl密度梯度离心StahlMeselson培养一代培养二代培养三代亲代子一代子二代轻带重带混合带•DNA半保留复制的意义：保证DNA代谢的稳定性。•经过多代的复制，亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，子代DNA仍可以保持与最初亲本的一致性。•稳定性是相对的，变异是绝对的在各种理化因素的作用下，DNA会发生损伤；在复制、转录的过程中，DNA会发生错误；在生长发育的过程中，DNA可能进行修饰、删除、扩增和重排。2、DNA复制的起点、方向和方式2.1DNA复制的起点•原核生物DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点（ori）。•原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。复制子(replicon)或复制单元：•DNA分子上一个独立的复制单位，DNA复制从起点开始，进行到终点结束。•一个复制子包括一个复制起点和复制终点。原核生物单复制起点，整个染色体只有一个复制子真核生物:多复制起点，一个genome中有多个复制子。复制起点具有特征性：•细菌、酵母以及叶绿体、线粒体等的DNA复制起点已经被克隆，其核酸序列的共同特点是富含A-T序列。2.2DNA复制的方向：多数DNA双向复制单向进行：有些病毒（如腺病毒等）、质粒DNA及线粒体DNA。图：DNA复制的方向性复制起点复制起点复制叉复制叉（Replicationfork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛。复制起点复制叉亲代链子代链复制叉真核生物DNA分子复制具有多个复制子，多个复制眼2.3DNA复制的方式•双向等速复制：大多数生物体内DNA。•不等速复制：如枯草杆菌。•对称复制：大多数生物体内的DNA的两条链同时复制。•不对称复制：在一定时期内DNA只复制一条链的情况。•如线粒体的D-环复制和噬菌体的滚环复制方式。3DNA聚合酶和DNA聚合反应DNA的复制是由DNA聚合酶负责完成的，按照模板催化合成新DNA链。Poly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→Poly(核苷酸)n+1－3’-OH＋2Pi4DNA复制的半不连续性DNA在复制时如何同时作为模板合成其互补链?•冈崎片段的大小：原核生物为1000-2000bp，真核生物100bp。前导链（leadingstrand）后随链（laggingstrand）冈崎片段（Okazakifragment）复制叉移动的方向半不连续复制:1.DNA聚合酶2.DNA连接酶3.螺旋酶4.单链结合蛋白5.DNA拓扑异构酶第二组：复制体系1DNA聚合酶DNA的复制是由DNA聚合酶负责完成的，按照模板催化合成新DNA链。•共同性质:[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为原料;[2]需要模板;[3]不能起始合成新的DNA链,需要引物;[4]合成方向5‘→3’。DNA聚合酶（DNApolymerase）1DNA聚合酶•1.1大肠杆菌的DNA聚合酶•1.2DNA聚合酶和复制的忠实性•1.3其它生物的聚合酶•1.4DNA聚合酶的引物1.1大肠杆菌的DNA聚合酶•DNA聚合酶Ⅰ:主要参与损伤DNA的修复，同时在半保留复制中有辅助作用，•DNA聚合酶II：主要参与DNA修复，•DNA聚合酶III：DNA合成的主要复制酶。1.1.1大肠杆菌DNA聚合酶ⅠDNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ1956年，ArthurKornberg(1)理化性质：•一条多肽链，103KD。•含一个Zn2+•400个分子/细胞，•37℃催化约1000bp/min,（2）功能特点1）5’→3’聚合功能2）3’→5’外切活性3）5’→3’外切活性4）5’→3’内切酶活性5'3'GTAAGTCG·····CTCAGC5'3'3'－5'外切核酸酶水解部位图11-20DNA聚合酶Ⅰ的3'－5'外切酶活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-16)3'5'GGACAAGA·····GACGTTCT5'3'内切酸酶水解部位图11-22DNA聚合酶Ⅰ的内切酸活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-20)5'3'GTAAGTCG·····CTCAGC5'3'3'－5'外切核酸酶水解部位图11-20DNA聚合酶Ⅰ的3'－5'外切酶活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-16)3'5'GGACAAGA·····GACGTTCT5'3'内切酸酶水解部位图11-22DNA聚合酶Ⅰ的内切酸活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-20)切口移位反应缺口平移标记DNA探针•枯草杆菌蛋白酶处理后，成两个片段，大片段68KD，称为Klenow片段。1.1.2大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：(1)理化性质：•120KD，•100个酶分子/细胞，•活性只有DNApolⅠ的5%。（2）功能特点：•5′→3′聚合活性•3′→5′外切活性，•没有5′→3′外切活性•不是复制的主要聚合酶,与DNA损伤修复有关。1.1.3大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)(1)理化性质：•10-20个酶分子/细胞。•活性是DNApolI的15倍,polII300倍。•聚合反应需要ATP的存在。•反应有很高的速度和高度的进行性。•进行性：聚合酶结合于单链模板不解离的能力。DNApolⅢ全酶有十种共18个亚基（2）结构组成和功能特点βDNA聚合酶Ⅲ含有以下4个不同的功能组分：1）核心聚合酶:由α、ε、θ三种亚基组成。功能：•α亚基具有5’-3’方向合成DNA的催化活性。•ε亚基具有3’-5’外切核酸酶的校对功能，•θ亚基促进ε亚基的作用。2）β二聚体β亚基以二聚体、环状的形式环绕着DNA并在DNA自由滑动，构成一个滑动钳。功能：滑动钳把全酶束缚在模板DNA上，保证高度的进行性。3）γ复合物•含有5种亚基：γ2δ1δ’1χ1ψ1。•功能:γ复合物是β滑动钳的载体，帮助β滑动钳结合到DNA上。•γ复合物有依赖DNA的ATP酶活性。•β二聚体自己并不能组装到DNA上，通过γ复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的。4）τ二聚体•功能：τ2将两个核心酶分子和一个γ复合物连接起来。•τ亚基是一个依赖于DNA的ATP酶。表E.coli中的三种DNA多聚酶DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ结构分子量103KD120KD850KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞40010010-20功能5→3’聚合酶+++（新生链合成）3`→5’外切酶+++5`→3’外切酶+－－1生物学活性核苷酸数／min100050约50,0000.05151.2DNA聚合酶和复制的忠实性•复制过程的忠实性是保证生物体遗传信息准确传递的一个必要条件，它取决于碱基配对的专一性。•DNA聚合酶可以通过以下方式提高互补碱基选择的专一性。1）碱基配对原则维持DNA复制的准确性：2）DNA聚合酶本身的校对作用DNApol的3’5’外切酶活性可切除错配碱基，使得DNA复制错误的机会只有10-8-10-10。3)需要RNA引物起始DNA复制，DNApol只能从引物的3’端延伸DNA碱基配对协同性使得最初几个碱基错配率高，而RNA引物最终被降解而避免错误。4）后随链的不连续合成因其有利于错配碱基的校正1.3其他生物的聚合酶•噬菌体也编码DNA聚合酶，它们是T4、T5、T7、SPIO1。这些酶都有5’-3’合成酶活性和3’-5’外切校正活性。•真核生物中发现了5种不同的DNA聚合酶，分别为α、β、γ、δ、ε。•前四个位于细胞核中，而γ是线粒体酶。1.4DNA聚合酶的引物(primer)•DNA复制为什么需要引物？•DNA聚合酶只能催化dNTP到已有核酸链的游离3’-OH上，而不能从游离核苷酸起始DNA链的合成。•DNA聚合酶需要引物来提供3’-OH末端，然后在其上加入核苷酸来延伸DNA链。DNA复制需要合成引物•通常细胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通过DNA聚合酶延伸RNA链的3’-OH。•为什么需要一段RNA序列作为引物来进行DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。引物合成1）大部分生物利用模板上合成一段RNA序列作为引物；2）环状DNA在内部形成一个缺口产生引物末端，如滚环复制3）直接引发合成，特殊蛋白质把核苷酸直接引入到聚合酶的催化位点。如腺病毒。2DNA连接酶（DNALigase）•1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。2.1基本性质：能将两段DNA拼接起来的酶，催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭DNA单链缺口。1）E＋ATP→E－AMP＋ppi（动物细胞和噬菌体）E＋NAD→E－AMP＋NMN（E.coli等细菌）2）E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化3）活化的5’-PO4与相邻的3’-OH作用形成3’－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。2.2功能特点：3解旋酶(helicase)功能特点：•解旋酶可以促使DNA在复制叉处打开双链，解开氢键，形成单链。•利用ATP水解获得的能量来打断氢键•二聚体或六聚体形式存在表11-3E.coli及噬菌体的解旋酶解旋酶结构功能DnaB330K六聚体结合与OriC,Oriλ参与前引发分离双链，水解ATP,提供能量。rep蛋白66K单体ATP依赖性解旋酶，在φX174滚环复制中推进复制叉PriA(w蛋白)82K单体φX174Rf形成中参与前引发体3’→5′移动取代SSB，识别特异位点。TraY/I多聚体F因子滚环复制中解链。基因4蛋白58KT7噬菌体复制中延5’→3′解链。4单链结合蛋白（SSBP）功能特点：•在E.coli中以四聚体存在•177个aa组成•74KDa•SSBP与螺旋酶不一样，不具备酶的活性，不和ATP结合。•SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。解旋酶•在原核中SSBP与DNA结合表现出协同效应:•一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP结合到相邻的DNA上。5DNA拓扑异构酶(DNATopoisomerase)•DNA复制在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。5.1功能：在DNA复制时，复制叉前方DNA分子部分产生正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。5.2类型1）拓扑异构酶I(TopoⅠ)：•作用特点：作用于单链DNA不需要ATP和任何等辅助因子。对环状单链、双链DNA有打结或解结作用，以及使环状单链DNA形成环状双链DNA。2）拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）：•也叫DNA旋转酶(DNAgyrase)•作用特点：作用双链DNA，需要ATP水解为ADP以供能量。能够环连或解环连，以及打结或解结。谢谢再见！