高级生物化学

1有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。固定相：固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂（即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液）。在薄层层析时流动相又称展层剂。层析：以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。操作容量：即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克（或每毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）来表示。其数值越大，表明基质对某种成分的结合力越强；否则反之。床体积（Vt）：通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）Vt是基质的外水体积（V0）和内水体积（Vi）以及自身体积(Vg)的总和，即Vt=V0+Vi+Vg。洗脱体积（Ve）：洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。外水体积(V0)：外水体积是指基质颗粒之间体积的总和。内水体积（Vi）：内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。基质体积（Vg）：基质体积是指基质自身所具有的体积。V0、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质的变化而变化的。膨胀度：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示，即每克溶胀基质所具有的床体积。一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。而迁移率是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。几种物质之间的分配系数或迁移率的差异程度，是决定它们采用层析方法能否分离开的先决条件。其差异程度越大，分离效果就越好。疏水层析:疏水作用层析，它是根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，进而设法将有效成分分离出来。反相层析：是有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质的方法，所用的载体结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质物质具有较大吸引力。凝胶过滤又叫分子筛层析，其原理在于凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质被排阻在外，当一混合溶液通过凝胶层析柱时，溶液中的物质就按分子质量筛分开了。亲和层析是利用生物大分子的特异的生物学性质—专一地对某一种或某一类物质可通过次级键结合的特性（亲和特性）进行纯化的方法，与层析法结合起来就是亲和层析法。亲和层析法使生物大分子的提纯变得简单、迅速和高效。双水相体系：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，构成双水相体系。常用双水相体系：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dextron）、PEG/磷酸盐2生物大分子物质制备基本原则：防止生物分子变性、降解1．控制适当的pH；2．控制低温；3．注意提取过程中的溶液环境（成分的变化）；4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基材料选择原则：含量多、稳定性好，来源丰富、保持新鲜，工艺简单、有利用价值。常用的测定方法：光谱法（紫外光谱法、可见光谱法、荧光法、浊度法）、电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器。测定核酸含量：当A260=1时，双链DNA50μg/ml、单链DNA37μg/ml、单链RNA40μg/mlA260/A280:纯DNA=1.8，纯RNA=2.0细胞的破碎：机械破碎、溶胀和自溶、化学处理、生物酶降解抽提有效成分的影响因子：pH值、溶剂的极性和离子强度（蔗糖、、水解酶、温度、搅拌、氧化（巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素C、多酚氧化酶）、金属离子、抽提液与抽提物的比例（5:1）盐析的影响因子：盐析常数Ks、盐分级范围的差异性、pH和盐浓度、蛋白质的纯度和浓度（0.2-2%）共沉淀现象离子交换剂由三部分组成：基质+电荷基团+反离子根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类：1．疏水性离子交换剂2．亲水性离子交换剂交联度：交联剂在基质中所占百分数离子交换剂的影响因子：交联度大，网孔小，膨胀度小，吸水量小。亲水性基质膨胀度大交换剂的电荷强度强，膨胀度大带同种电荷或解离度大时（pH远离pK）膨胀度大交联度越大，各因素影响越小交换容量总交换容量：配体实际数量决定，与测定条件无关有效交换容量：可用配体数决定，与测定条件有关影响交换容量的因素：筛孔、离子强度、pH值离子交换剂的选择1、正确选择阴阳离子交换剂2、强弱型离子交换剂的选择生物大分子常用弱酸碱性离子交换剂3、不同离子型交换剂的选择为提高交换容量，一般选择结合力较小的反离子强酸强碱型分别选择H型和OH型弱酸弱碱型分别选择Na和Cl型4。不同基质的选择生物大分子宜选用亲水性基质离子交换剂缓冲液的选择：用阴离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值高一个单位3用阳离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值低一个单位3。洗脱液：离子强度↗阳离子交换剂↗pH（逐渐接近pI）阴离子交换剂↘提高吸附剂的操作容量：在配体和基质间引入“手臂”、增加配体取代的程度、配体与基质以最少的键连接、基质多孔性的影响、其他（样品浓度、pH、离子强度、上样、洗脱速度）1、抽提的含义用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。理想抽提液之条件A.对有效成分溶解度大，破坏作用小B.对杂质不溶解或溶解度很小C.来源广泛、价格低廉、操作安全2、纯化方案的设计纯化方法的选择依据：有效成分与杂质的理化性质差异，如溶解度、电荷性质、分子量大小、对配体亲和力的差异等。原则：先用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法，后用精确、费时和需样品量少的方法。同一方案中忌重复使用一种分离方法生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法生物组织→→提取液→→粗产品→｛电泳法｝→结晶超离心法透析和超滤│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│前处理：1、材料选择与处理2、细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）粗分级：盐析（硫酸铵盐析）、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、离心细分级：依据原理：分子大小、溶解度、电荷性质、吸附性质、生物亲和力纯化方案的评价对每一次收集的溶液进行有效成分多指标测定A含量测定（蛋白总量）（总活力）、B比活力（活力单位数/毫克蛋白）C纯化倍数（每步比活力/粗抽提液比活力）D收得率（每步总活力/粗抽提液总活力*100%）各指标需综合考虑3盐析曲线制作4a/曲线制作方法b/确定最佳盐析范围曲线制作步骤：1.取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调pH至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵。2.第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。3.以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。4.如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分.5.将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可的如图2-1所示的盐析曲线.6.在此曲线的基础上，参照表2-3的分级试验方法，根据材料来源的难易程度、有效成分纯度和得率要求等做出判断。4有机溶剂的抽提方法用苯酚、氯仿（蛋白质变性剂）反复处理，可使核酸-蛋白分离。离心后收集上层含核酸水相。P34饱和酚→酚-氯仿-异戊醇→氯仿-异戊醇→乙醚5装柱、上样和洗脱的过程装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。而湿装法系统先适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的四分之一到三分之一时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸泡在溶剂中，严防气泡产生。后一种装柱法对各种基质都适合。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在约50cm高的操作压下，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。经过平衡的层析柱，当平衡液留到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的二分之一。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱。同时在柱下端与部分收集器连通，立即进行分级收集。随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线。6为什么凝胶过滤时大分子先洗脱出来？凝胶过滤是利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。7聚焦原理1.pH梯度溶液的形成（A/离子交换层析中pH梯度的形成B/等电聚焦pH梯度的形成—正极-硫酸，阴极-NaOH，载体两性电解质在两极间排布，停在各自pI=pH处，聚焦完成，电流为零。）5如当柱中装多缓冲交换剂（阴离子交换剂）PBE94（固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含polybuffer96的多缓冲剂作流动相（调pH到6）进行洗脱。随着洗脱的进行，流动相中物质按酸性最强---最弱的顺序，先后与柱中碱性最强-最弱的多缓冲交换剂结合发生中和作用，使柱内每点pH值从高到低（从9--6）逐渐下降，经过一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6—9的梯度，此梯度是在洗脱过程中自动形成的。但是随着洗脱的进行，pH梯度会逐渐下行，从底部流出的pH从9降至6，最终恒定于此值，此时层析柱的pH梯度就消失了。（见图8--2）8聚焦效应的原理蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应，pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。9疏水层析和吸附层析的区别1、固定相：疏水层析的固定相是亲水性或者疏水性基质加上疏水性基团（配体),而吸附层析的固定相为颗粒状极性与非极性的吸附剂2、流动相:疏水层析的流动相洗脱剂由高盐到低盐，极性大到极性小的顺序流动，而吸附层析的流动相为根据盐梯度流动的极性物或者非极性的有机溶剂3、洗脱物：疏水层析洗脱顺序为极性大的物质到极性小的物质，而吸附层析洗脱顺序为极性小的物质到极性大的物质。10怎样正确的选择离子交换剂？1）正确选择阴阳离子交换剂若被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；若带负电荷，应选择阴离子交换剂；若被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定PH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。2）强弱型离子交换剂的选择生物大分子常用弱酸碱性离子交换剂3）不同离子型交换剂的选择为提高交换容量，一般选择结合力较小的反离子；强酸强碱型分别选择H型和OH型；弱酸弱碱型分别选择Na和Cl型4）不同基质的选择生物大分子宜选用亲水性基质离子交换剂11缓冲液的选择？1）缓冲液的pH和离子强度直接影响分离物的交换容量2）起始缓冲液的pH和离子强度应有利于样品中的有效成分与离子交换剂结合，而杂质不能结合。或相反。离子强度以0.1为宜。用阴离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值高一个单位用阳离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值低一个单位3）洗脱液：离子强度应高于缓冲液阳离子交换剂↗pH（逐渐接近pI）阴离子交换剂↘4）缓冲液选择的关键在于了解有效成分的等电点，而未知样品则