2015校本部医学分子生物学

第一部分一、名词解释：基因：携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子。ORF：“开放阅读框”，基因中编码蛋白质的序列，不包括,基因中的调控序列和其它非编码区C值：一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。C值矛盾：在真核生物DNA中有许多重复序列以及内含子等非蛋白编码序列，使其DNA总量，即C值与所表现出来的进化复杂性无关甚至矛盾的现象。基因组：一个细胞内的全部遗传信息，包括染色体基因组和染色体外基因组。重叠基因：同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。SNP：单核苷酸多态性，由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。蛋白质组：由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein)。质谱技术：将样品分子汽化并电离成离子，通过测定离子的质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量分析。PMF:肽质量指纹图，蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱，通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质。基因工程：基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品限制性核酸内切酶，一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸的核酸水解酶。逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶，能以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA。粘性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。载体：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。多克隆位点：载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位。报告基因：一个表达产物非常容易被鉴别的基因，利用其表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。转化：将质粒导入大肠杆菌或其它细胞的过程。感受态细胞：理化方法诱导细胞，使细胞膜出现一些孔洞，使其适合摄取和容纳外来DNA的生理状态。二、问答题1简述SNP研究的意义。（单核苷酸多态性）SNP--由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。•据估计，人类基因组中每1kp就存在一个SNP位点，共有约300万个之多，是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性。•相当一部分SNP还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。•大多数SNP位点十分稳定，人类85%的SNP是共有的。•2何谓蛋白质组学？请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。•第一是样品的预处理；•第二是蛋白质的分离（双向凝胶电泳或液相色谱分离）；•第三是蛋白质的鉴定及其性质和功能的研究。3简要介绍酵母双杂交技术的原理及其用途反式转录激活因子的DNA结合功能域和转录激活结构域在空间上较为接近时，呈现完整的GAL4转录因子活性，并激活上游激活序列的下游启动子，转录启动子下游基因。1、发现新的蛋白质和蛋白质心功能2、在细胞内研究抗原和抗体的相互作用3、筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间的相互作用的影响4、建立基因组蛋白连锁图4简单介绍质粒及其在分子生物学研究中的应用细菌染色体以外的小分子双链环状DNA，能够自我复制并表达。1用于保存和扩增2kb的目的DNA，2构建cDNA文库；3目的DNA测序；4核酸杂交的探针。5作为克隆载体的质粒应具备哪些特点？①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。④分子量相对较小和较高的拷贝数。此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可。6简述分子克隆技术的基本步骤。1、获取目的基因，2、选择载体，3、连接目的基因与载体，4、重组DNA导入受体细胞；5、重组体筛选7简述蓝白斑筛选实验的原理。pUC质粒含有Ampr和lacZ基因，lacZ基因编码B-半乳糖甘酶氨基端的一个片段，该片段能与宿主细胞的缺陷型B-半乳糖苷实现基因内互补，形成完整的B-半乳糖甘酶，该酶能催化指示剂底物形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ基因含有多克隆位点，当外源基因插入多克隆位点时，laca-肽基因阅读框架破坏，细菌内无B半乳糖甘酶活性，菌落呈白色。8简述重组体的筛选和鉴定的方法。遗传标记表型特征筛选：抗生素抗性标记筛选，半乳糖甘酶基因失活筛选，营养标记选择；重组子结构特征筛选：重组子大小鉴别筛选；酶切鉴定；PCR筛选：基因扩增和测序；核酸杂交技术筛选第二部分一、名解巢式PCR：使用两对引物，一对引物序列在模板外侧，另一对引物序列在模板内侧，第一队引物做PCR的产物作为第二对引物退火模板再做PCR。逆转录PCR：RNA在反转录酶及反转录引物作用下反转录cDNA，再以该cDNA为模板进行PCR。多重PCR：在PCR反应体系中加入多对引物，同时扩增产生多个核酸片段。不对称PCR：采用50-100：1的高浓度引物和低浓度引物扩增，在第15个循环后可以产生大量单链DNA。原位PCR：直接在组织细胞内进行的PCR反应，具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术优点。荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K等破碎细胞，消化蛋白，然后用PH8的Tris饱和酚或酚-氯抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀，获取大小为100-150kb的DNA。煮沸裂解法：将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备SDS裂解法：将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA变性DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象，变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变碱裂解法：在NaOH提供的高PH值（12-12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。融解温度：将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，称融解温度退火：热变性的DNA经缓慢冷却后的复性过程。分子杂交：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程。核酸探针：指用来检测某一特定核苷酸顺序或基因顺序的有同位素或非同位素标记的已知DNA片段。Southern印迹：是将存在于凝胶中的DNA分子转移（印渍）于固定化介质上并加以检测分析的技术。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记的DNA与固着于滤镜上的DNA杂交，经放射自显影锁定与探针互补的电泳条带的位置。该技术主要用于基因组DNA的分析。Northern印迹：是将存在于凝胶中的RNA分子转移（印渍）于固定化介质上并加以检测分析的技术，可以用合成的寡核苷酸片段作为探针，也可以用克隆或提取的DNA片段作为探针进行标记，特点专一性好，假阳性率低，用于RNA水平分析等。[1]原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法二、简答题1、什么是PCR技术？PCR体系的五要素及其原理？聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）：在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促反应。是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。五要素：模板DNA，四种dNTP，引物，TaqDNA聚合酶，缓冲液及Mg离子。基本原理：变性（94-95度双链间氢键断裂）、退火（37-58度时碱基互补原则下退火复性，半保留复制）、延伸（60-72度时TaqDNA聚合酶使引物从5’-3’端按照碱基互补配对原则炎单链模板延伸）。2、核酸的纯化的基本原则及应达到哪些要求？基本原则：1保证核酸一级结构完整；2排除其他分子污染，保证核酸样品的纯度。纯化要求：1核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；2其他生物大分子的污染降至最低程度；3排除其他核酸分子污染。3、DNA降解的可能原因及对策？原因：1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融对策：1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融4、DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应原因及对策？原因：1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子对策：1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次5、如何保持核酸的完整性？核酸一级结构储存全部遗传信息，还决定高级结构的形式以及和其它生物大分子的结合方式，在分离、纯化过程中需注意保持其完整性：1温度不要过高，控制在0-4度，2控制PH值范围在4-10之间，3保持一定的离子强度，4减少机械破坏。6、Taqman技术的原理？Taq酶具有5’外切酶活性，能够裂解双链DNA的5’端核苷酸，释放单个核苷酸。基于Taq酶的此种特性，设计合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5’端标记一个荧光分子，3’端标记另一个荧光分子，其中3’端的荧光分子能够吸收5’端的荧光分子的荧光信号。但当有特异的PCR产物时，该探针与模板退火，及产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了两荧光分子间FRET，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算初始模板数量。7、理想的探针标记物应具有哪些特点？①高度灵敏性；②与探针的结合不影响探针的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性；③显示或检测要简便、节时、准确可靠、重复性好；④对环境无污染，对人体无损伤。8、分子杂交的一般过程？☆探针制备及标记（同位素或非同位素）☆待测核酸样品制备（分离，纯化）☆杂交（液相，固相，原位杂交）☆杂交后处理（去掉非特异杂交分子）☆显示结果（显色，发光，放射自显影）☆结果分析9、分子诊