2012总DNA的提取及PCR技术讲义-盖英萍

实验三植物总DNA的提取一、原理细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA或染色体DNA，也有人称之为基因组DNA(genomicDNA)，严格地讲，基因组DNA是指单倍体细胞核DNA。细胞质中含有少量的DNA，称为核外DNA或核外基因。主要分布在线粒体及叶绿体内，分别称为线粒体DNA(mtDNA)及叶绿体DNA(ctDNA)。细胞内各种DNA总称为总DNA(totalDNA)。根据实验需要可分别提取不同的DNA。植物核DNA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交，也可以提取总DNA进行Southern杂交。核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。高等植物核DNA的分子量为1012左右，约含有109bp，就其长度与直径的比例而言，是一个极不对称的分子。如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感，虽然现在已能够成功地测定出它的一级结构，但到目前为止，仍无法分离纯化出它的完整分子。在分离纯化过程中，DNA分子的降解是很难避免的。因而分离纯化所得到的只不过是植物核DNA分子的片段。采用不同的分离方法，所得的片段大小有所不同。用于Southern杂交的植物DNA样品在长度上应不小于50Kb。线粒体DNA及叶绿体DNA的分子要小得多，分子量约为107，而且为环状结构，因此完整的线粒体DNA及叶绿体DNA的分离并不十分困难，现已有许多报道。核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA的提取一般是先分离出细胞核及细胞器，然后再提取DNA。总DNA的提取不必分离细胞核及细胞器，用温和的方法使细胞破碎后，核蛋白体自然释放出来。（一）方法概述植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同，为获得高质量DNA应选取幼嫩组织或组织培养物为材料，由于植物材料中DNase水平低，蛋白质含量较少，其操作要点主要是克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖对DNA制备的影响。关于植物总DNA的提取方法有关文献报道很多，但从提取原理上看主要有两种：CTAB法和SDS法。1.CTAB法：CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(≥0.7mol／LNaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol／LNaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之被除去。CTAB提取缓冲液的经典配方中各试剂的作用：CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；NaCl提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相中；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。操作的主要程序是植物材料冷冻研磨成粉后，加入高盐提取缓冲液，于56℃保温若干时间，使细胞破碎，核蛋白体解析，蛋白质变性。提取液中含有β-巯基乙醇可防止材料中的多酚类物质氧化。然后用氯仿／异戊醇抽提，去除蛋白类物质。若一次抽提效果不理想，可补加少量高盐、高浓度CTAB溶液，继续用氯仿／异戊醇抽提。抽提后的水相，加入不含盐的CTAB沉淀缓冲液，降低溶液的盐浓度使核酸与CTAB形成的复合物沉淀，离心收集沉淀后再将沉淀溶于高盐溶液，然后根据后继实验对DNA纯度的要求，或者通过CsCl—EB密度梯度离心纯化，去除所有的蛋白质、多糖、RNA、寡核苷酸等不纯物，得到高纯度的DNA样品；或者向溶液中加入RNase，水解去除RNA，然后用氯仿抽提，最后用乙醇沉淀、经洗涤得到不十分纯的DNA样品。这两种处理所得的DNA样品均可直接用于限制性酶切及Southern杂交。只是样品纯度不同，杂交效果有所差异。CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当调整也适用于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB提取缓冲液。用新鲜材料提取时使用2×CTAB提取缓冲液。实验需要注意的问题是CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。另外CTAB在氯仿溶液中有少量的溶解，因而在用氯仿抽提后须用含0.7mol／LNaCl、10％CTAB的溶液进行补充，以维持体系中的CTAB浓度在正确水平上。加入沉淀缓冲液后如果不发生沉淀，则表明盐浓度较高，可用沉淀缓冲液稀释。CTAB与核酸的复合物发生沉淀时，多糖、色素、多酚类化合物不应发生沉淀，所以得到的DNA沉淀应为白色或灰白色。有时提取的产物带有颜色，限制性内切酶酶切困难，这是因为材料中含有较多的多酚类物质，该类化合物氧化后易与DNA共价结合呈现褐色并抑制酶切反应，遇到这种情况时可以提高提取缓冲液中巯基乙醇的含量(提至2％～5％)，并尽可能选用幼嫩的材料。另外离心收集CTAB与核酸形成的复合物沉淀时注意不要过度离心，否则所得的沉淀再溶解困难。与下面介绍的SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。该法去多糖的原理：CTAB具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖留在溶液中。在高离子浓度下，CTAB与蛋白质和除大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。在一定的盐浓度下，DNA、蛋白质与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA，如果后继实验对二者都需要，则可分别进行纯化，如只需要DNA则可用RNase水解掉RNA。2.SDS法：SDS（sodiumdodecylsulfate）十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂，能在较高温度(55-65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5mol／L的KAC于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。在使用上述方法的过程中，一些实验者根据从不同植物材料提取DNA时所遇到的问题，对具体方法进行了各种改进，最典型的是对于细胞破碎较困难的植物材料在使用SDS时辅以蛋白酶K，使SDS与蛋白酶K在EDTA存在下共同破碎细胞。蛋白酶K是从霉菌中制备的，它具有很强的水解蛋白质的能力，作用范围也很广，在SDS及EDTA溶液中仍具有活性，这是该酶的一大特点，故可以将其与SDS合用，有人将这种方法称为SDS-蛋白酶K法。再如对于含多酚类物质较多的植物，如马铃薯、番茄等，在提取液中加入6％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，PVP可与多酚类物质结合形成复合物，再经离心而被除去，还有的在提取缓冲液中加入8mol／L的尿素代替SDS等。SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。该方法所得的DNA样品也可直接用于Southern杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。最后需说明的是，用该法提取的DNA如果因后继实验在纯度上的要求，必须用氯化铯密度梯度离心纯化的话，那么提取时应用Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)代替SDS。因为Sarkosyl能溶解在低浓度的氯化铯溶液中。植物细胞具有细胞壁，植物总DNA提取时如何在使植物细胞壁有效破碎的同时尽量保持DNA的完整，是提取的重要一环。许多细胞破碎的方法都会引起DNA严重的机械断裂，因而植物DNA提取时很难在产品的质量(长度)及产量之间都达到满意的结果。国外文献中多用冷冻干燥的材料进行提取，因冷冻干燥的材料很容易粉碎，研磨时组织破碎效率高，而且在冷冻干燥状态下，DNase活力极低，研磨时不会引起DNA降解。同时，冷冻干燥又是保存植物材料的最好方法，冷冻干燥的材料在脱水的状态下贮存几年，DNA都不会有明显的变化，可以在植物各个生理状态下分别取材，经冷冻干燥后保存到需要的时候一同提取DNA。但由于制备冷冻干燥的材料需要冻干机，使这种方法在一般实验室使用受到限制。1976年国外报道了将植物材料小块置液氮中冷冻，并在冷冻状态下研磨成粉，然后再加入去污剂、蛋白酶等试剂，使细胞充分破碎的方法，效果比较理想。很快，这种植物细胞破碎的方法被广泛采用。采用这种方法时，操作中应注意以下几个问题：①当植物材料表面或内部含有较多水分时，液氮冷冻会形成冰晶而妨碍研磨。所以，在液氮冷冻前，植物材料表面的水分一定要用滤纸吸干。对于含水量大的新鲜植物材料，如某些植物叶片、疏松的愈伤组织，冷冻前用乙醇擦拭，使之部分脱水。②研磨使用的器皿(包括角匙)要在液氮中预冷，研磨的全过程均应在冷冻状态下进行，不允许材料在研磨过程中融化，为保持材料的冷冻状态。研磨过程中可断续向研钵内加入液氮，但这种操作常会因添加液氮过猛而使材料被冲散出容器，很难再收集，尤其是在研磨后期很容易发生，所以要注意轻缓地操作。另外，在液氮中的材料不好研磨，只有在液氮蒸发殆尽时，才好研磨，所以建议采用将研钵置液氮浴中，断续向研钵外添加液氮的作法，可以克服上述问题。③样品研磨成粉后，在加入提取缓冲液前必须保持其冷冻状态，如果融化，内源DNase会引起DNA降解，严重影响提取效果。DNA降解主要来自提取过程中的物理因素及DNase活性，因此防止DNA降解要从这两方面出发。物理因素主要是机械剪切力，溶液在震荡、搅拌、转移、反复冻融、渗透压骤变及细胞急剧破裂内容物外泄时都会产生强的机械剪切力，因而提取时的各种操作均应温和地进行，避免剧烈振荡，转移DNA溶液的枪头要剪去尖部，扩宽管口，吸取过程中避免产生气泡，尽量避免用反复吸打的方法助溶DNA沉淀等。为防止DNase的降解作用，提取时使用的器具、研钵、离心管、溶液等要经过高压灭菌。由于DNase以Mg2+、Ca2+二价离子为激活剂，所以在提取液中需加入二价离子螯合剂EDTA来消除外源及内源的酶活性。（二）植物总DNA提取的实验设计1.提取方法选定植物总DNA提取的方法很多，实验前要根据植物材料的情况及选用的检测方法来确定。如果采用PCR扩增鉴定转化体，或先经PCR扩增，然后再进行Southern杂交检测时，可选用快速微量的SDS法，因PCR技术对DNA样品量及纯度的要求均不高，甚至可以直接用组织匀浆进行扩增，同时又因PCR具很高的灵敏性，为防止试剂交叉污染，应尽量减少提取步骤。如果直接采用Southern杂交来鉴定转化体，由于Southern杂交对DNA样品的数量及质量要求都较高，需要的样品量在5～15μg，而且要较纯，所以对于含酚类物质及糖类物质较高的植物材料，采用CTAB法是比较理想的。CTAB法可以不通过氯化铯密度梯度离心使DNA与绝大部分多糖类物质分离，并能获得大于50Kb的较纯的DNA分子。同时该方法对材料数量的要求也不苛刻，单个胚、胚珠，或是毫克量的干燥植物材料都能通过CTAB法提取出供杂交使用的DNA，所得的DNA样品可以在几小时内被限制性内切酶消化。2.实验材料准备检测外源基因是否整合及分析整合情况时，均需有严格的对照。因而实验前不仅要准备好经转化处理的待测材料，而且还要准备好未经转化处理的阴性对照材料。两种材料的生理状态及取材部位要相同，并应以同样的方法提取。3.植物材料量及DNA样品量DNA提取前首先要考虑的问题是DNA的提取量，即提取多少DNA样品够检测时使用，而提取这些DNA又需要多少植物材料。这是实验设计中的重要一环。检测时所需植物DNA的样品量是由检测方法的最小检出量及被检基因在基因组中的含量决定，而所需的植物材料的量则由所需的DNA样品量及所用的提取方法对该种植物材料的DNA产率决定。表2-1中列出了一些植物材料的DNA提取产量及细胞基因组的大小,供实验参