2酶学.

酶的结构与功能生命科学学院张林生Chapter2在生物化学发展历史上，酶学是个经久不衰的主题，其一：代谢途径及其调控机制的阐明有赖于关键酶的分离、纯化及其动力学和调控的研究；其二：许多酶又是研究蛋白质、核酸和聚糖结构与功能的重要工具。随着生物化学和分子生物学相关领域以及其它学科的发展，尤其是结构生物学、蛋白质组学、基因工程、蛋白质工程和免疫学的理论和技术向酶学的渗透，为酶学发展注入新的活力。当前，酶学发展主要有两大方向：即分子酶学和应用酶学。分子酶学重点研究酶的分子生物学，酶的分子结构、作用机制和调控，酶的合成、分拣、转运和定位等。应用酶学则包括酶法分析、酶工程、组织酶学、药理酶学、食品酶学等。酶的提纯酶的提纯双水相萃取法双水相萃取法----TwoTwo--aqueousphaseextractionaqueousphaseextraction1.1%1.1%右旋糖苷右旋糖苷+0.36%+0.36%甲基纤维素甲基纤维素人生长激素提取人生长激素提取右旋糖苷右旋糖苷0.39%0.39%甲基纤维素甲基纤维素0.65%0.65%右旋糖苷右旋糖苷1.58%1.58%甲基纤维素甲基纤维素0.15%0.15%不均一相不均一相用于分离的体系用于分离的体系::PEG/PEG/DextranDextranPEG/DextranPEG/Dextran硫酸盐硫酸盐PEG/PEG/硫酸盐硫酸盐PEG/PEG/磷酸盐磷酸盐•人生长激素的分离•用PEG400/磷酸盐体系从大肠杆菌细胞碎片中提取人生长激素，当pH=7，菌体含量为1.35%的干细胞，混合5~10秒后，就可以达到萃取平衡，生长激素在上相，进行三级错流萃取，回收率可达81%,纯化系数8.5。酶的提纯酶的提纯反胶束反胶束(reversedmicelle)(reversedmicelle)萃取法萃取法反胶束反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的一种聚集体是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的一种聚集体临界胶束浓度临界胶束浓度----CMC:CMC:胶束形成的最低表面活性剂浓度胶束形成的最低表面活性剂浓度反胶束反胶束(reversedmicelle)(reversedmicelle)萃取法萃取法AOT:AOT:丁二酸丁二酸--22--乙基己基酯磺酸钠乙基己基酯磺酸钠•pH9.0，核糖核酸酶a不被AOT萃取•CKCl=0.5mol/L，细胞色素c不被AOT萃取，正萃取•pH=11.5，溶菌酶不被AOT萃取反相层析中的离子配对试剂的作用反相层析中的离子配对试剂的作用反相层析中的离子配对试剂的作用反相层析中的离子配对试剂的作用•疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。•疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。•在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。•这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。2.1.酶促反应动力学•化学热力学说明反应的起点和终点，解决反应的方向和限度。动力学研究反应速度及各种因素如何定量地影响反应速度。酶仅在热力学允许的范围内加速反应进程，或将耗能反应与放能过程相偶联。•酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。化学动力学基础•化学反应的两个基本方面:•反应进行的方向、可能性和限度，属于化学反应热力学范畴。•反应进行的速率和反应机制，属于化学动力学的研究范围。•∆G并不与反应速率正相关反应速率及其测定•反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。反应级数•一级反应:不管底物浓度是多少，半衰期恒定•二级反应:半衰期与底物浓度成反比•零级反应:半衰期与初浓度成正比v=k底物浓度对酶反应速率的影响substratesaturationcurves2.1.1单底物酶促反应动力学•LenoreMichaelisandMaudL.Mentenproposedageneraltheoryofenzymeactionin1913consistentwithobservedenzymekinetics.•Theirtheorywasbasedontheassumptionthattheenzyme（E）anditssubstrate（S),associatereversiblytoformanenzyme-substratecomplex,ES•2.1.1.1Michaelis—Menten方程：][]S[/]][[][/]][[][][][][][][][][]][[][]][[0][][]][[][max222121121211SKKSEEKSEkEESEESkEESkEESSEKkkkkkkESSEESkESkSEkdtESdmmmTTTmmaxmaxmaxmaxmax][]S[]S[]S[K]S[]S[21]S[][]S[SKKKKSKmmmmm《当》当当一级反应零级反应•Baseonthreeassumption:–Steadystateassumption–InitialVelocityAssumption–[S0]≫[ET]assumption]S[21maxmK当Km值就代表反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度•1.Thereactioninvolvesonlyonesubstrate,orifthereactionismultisubstrate,theconcentrationofonlyonesubstrateisvariedwhiletheconcentrationofallothersubstratesisheldconstant.•2.ThereactionES→E+Pisirreversible,ortheexperimentislimitedtoobservingonlyinitialvelocitieswhere[P]=0.•3.[S]0[ET]and[ET]isheldconstant.•4.Allothervariablesthatmightinfluencetherateofthereaction(temperature,pH,ionicstrength,andsoon)areconstant.米氏方程必须满足的条件：•（1）米氏常数是酶的特征常数之一，每一种酶都有它的Km值，Km值只与酶的结构和所催化的底物有关，与酶浓度无关。•（2）判断酶与底物亲和力的大小。Km值小，表示用很低的底物浓度即可达到最大反应速度的一半，说明酶与底物亲和力大。可用1／Km近似地表示亲和力，1／Km愈大，酶与底物的亲和力愈大，酶促反应愈易进行。•（3）判断哪些底物是酶的天然底物或最适底物（即Km值最小的底物）。•（4）判断正逆两向反应的催化效率。如一个反应的正逆方向由同一个酶催化，则Km值较小的那向反应催化效率较高。•（5）求出要达到规定反应速度的底物浓度，或根据已知底物浓度求出反应速度。2.1.1.2Km和Vmax的意义•催化常数（catalyticnumber）（Kcat）也称之转换数(turnovernumber)。一个动力学常数，是在底物浓度处于饱和状态下，一个酶（或一个酶活性部位）催化一个反应有多快的测量。•催化常数等于最大反应速度除以总的酶浓度（Vmax/[E]total），或者是每摩尔酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的摩尔数。2.1.1.3催化常数（Catalyticconstant,Kcat）或转换数（turnovernumber,TN）常用Kcat/Km表示酶的催化效率，为酶专一性的定量尺度。胰凝乳蛋白酶,2.1.1.4作图法求Km和Vmax•（1）Lineweaver-Burk作图法：•（2）Eadie-Hofstee作图法：•（3）Hanes-Woolf作图法：•（4）Eisenthal和Cornish-Bowden作图法2.1.2多底物酶促反应的动力学2.1.2.1双底物双产物酶促反应动力学分类（1）序列有序反应（2）序列随机反应（3）乒乓反应顺次式(sequential)两种不同模式的双底物反应随机次[顺]序丙酮酸乳酸序列有序反应肌氨酸磷酸肌酸序列随意乒乓式(ping-pong)P2P2乒乓反应—氨基酸的转氨基反应吡哆醛天冬氨酸草酰乙酸酮戊二酸谷氨酸2.1.2.3双底物产物反应的动力学方程•（1）序列机制的反应动力学方程及作图•KmA是指在B的浓度达到饱和浓度时，A的米氏常数，在B的浓度低于饱和浓度时所测得的随[B]而变的A的各个Km称为表观米氏常数。序列反应的动力学方程•如交于横坐标上，说明固定浓度底物与酶的结合不影响变量底物的Km，即A和B的浓度大小彼此互不影响各自的Km，此时表观Km=Km•如直线的交点在横坐标以下，说明A的表观Km随B的浓度升高而升高•如直线的交点在横坐标以上，说明A的表观Km随B的浓度升高而降低（2）乒乓机制的反应动力学及作图2.2酶的抑制作用凡能降低酶催化活性的物质均可认为是酶的抑制剂。酶在抑制剂作用下活力下降甚至丧失，称为抑制作用。（1）抑制程度表示方法：1．相对活力分数（残余活力分数）a=Vi/Vo2．相对活力百分数（残余活力百分数）a%==Vi/Vo*100%3．抑制分数指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo4．抑制百分数i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100%通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。（2）抑制作用的分类：根据抑制作用是否可逆:不可逆的抑制作用:抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用.可逆的抑制作用:可逆的抑制作用:抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活.可逆抑制作用分为3种类型：(1)竞争性抑制(2)非竞争性抑制:(2)非竞争性抑制:(3)反竞争性抑制反竞争性抑制:•（3）不可逆抑制与可逆抑制的鉴别：•物理方法处理:透析,超滤,凝胶过滤;;•动力学方法:动力学方法:•Therearetwobroadclassesofenzymeinhibitors:reversibleandirreversible.•Irreversibleinhibition：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制•Reversibleinhibition:抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。•Reversibleinhibition•竞争性抑制（Competitiveinhibition）•非竞争性抑制(noncompetitiveinhibition)•反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)2.2.1可逆抑制作用•2.2.1.1竞争性抑制KmKi－KiK'mKm斜率=[I]1Vmax1v1Km－1K'm－1[S][I]增大对照图2.9竞争性机制Lineweaver-Buck作图法图2.10竞争性抑制二次作图法竞争性抑制（Competitiveinhibition）•aninhibitor,I,bindsreversiblytotheenzymeatthesamesiteasS.S-bindingandI-bindingaremutuallyexclusive,competitiveprocesses.•SandImustshareahighd