2015-2016发酵与酶工程实验

酵母蔗糖酶实验一、实验目的了解微生物发酵需控制的发酵条件熟悉酶学性质的组成内容与测定方法了解对酶改造的方法与改造后酶的指标了解影响酶活性的常见外界因素实验一酵母菌的培养实验二蔗糖酶的粗提实验三蔗糖酶的酶学性质研究实验四酵母蔗糖酶的改造实验一酵母菌的培养斜面培养基发酵液体培养基豆芽汁100ml葡萄糖5.0g琼脂2.0g自然PH0.1MPa高压蒸汽灭菌20min蔗糖20.0g/L蛋白胨5.0g/LNa2HPO44.0g/LMgSO40.5g/LKH2PO41.0g/LpH5.0~5.50.1MPa高压蒸汽灭菌20min←全班配置150ml（每大组约4支试管）←每大组配置200ml，准备两个250ml锥形瓶斜面培养基→接种→28℃恒温培养2天发酵液体培养基→斜面菌株接种两环→28℃的恒温摇床110r/min中培养2d酵母蔗糖酶的粗提流程收集菌体洗涤菌体重悬菌体破碎菌体上清液加热除杂蛋白有机溶剂沉淀目标蛋白溶解沉淀得粗酶液具体步骤参照实验讲义实验二蔗糖酶的粗提最适PH的测定最适温度的测定米氏常数和最大反应速度的测定温度稳定性的测定金属离子对酶活性的影响测定葡萄糖标准曲线的制作管号操作空白标准葡萄糖浓度梯度012345葡萄糖标准液(ml)(1mg/L)0.20.40.60.81.0蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.0DNS试剂(ml)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至25ml比色以0号管为空白参比，测定540nm处的吸光度记录吸光值（A540）最适PH测定溶液pH缓冲试剂体积ml缓冲试剂体积ml2.50.2mol/L磷酸氢二钠2.000.2mol/L柠檬酸8.003.00.2mol/L磷酸氢二钠3.650.2mol/L柠檬酸6.354.00.2mol/L乙酸钠1.800.2mol/L乙酸8.205.00.2mol/L乙酸钠7.000.2mol/L乙酸3.006.00.2mol/L乙酸钠9.500.2mol/L乙酸0.507.00.2mol/L磷酸氢二钠6.100.2mol/L磷酸二氢钠3.908.00.2mol/L磷酸氢二钠9.470.2mol/L磷酸二氢钠0.53缓冲液配制最适PH测定管号01234567对应PH自然2.5345678蔗糖溶(ml)(0.2mol/L)00.20.20.20.20.20.20.2缓冲液(ml)2.0水1.81.81.81.81.81.81.8粗酶液（ul）050505050505050反应温度37℃NaOH(1mol/L)(ml)反应10分钟后加入1mlDNS试剂(ml)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至20ml比色以0号管为空白参比，测定540nm处的吸光度记录吸光值（A540）最适温度测定管号012345678蔗糖溶(ml)(0.2mol/L)00.20.20.20.20.20.20.20.2缓冲液(ml)PH51.8粗酶液（ul）50反应温度3030405060708090100NaOH(1mol/L)(ml)反应10分钟后加入1mlDNS试剂(ml)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至20ml比色以0号管为空白参比，测定540nm处的吸光度记录吸光值（A540）温度稳定性的测定（以90℃温浴为例）可多做几个温度管号01234567蔗糖溶(ml)(0.2mol/L)00.20.20.20.20.20.20.2缓冲液(ml)PH52.01.81.81.81.81.81.81.8粗酶液（50ul时间h）000.51.01.52.02.53.0反应温度37℃NaOH(1mol/L)(ml)反应10分钟后加入1mlDNS试剂(ml)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至20ml比色以0号管为空白参比，测定540nm处的吸光度记录吸光值（A540）米氏常数和最大反应速度测定管号0123456蔗糖溶(ml)(0.2mol/L)00.20.40.81.01.42.0缓冲液(ml)PH52.01.81.61.21.00.60.0粗酶液（ul）50505050505050反应温度37℃NaOH(1mol/L)(ml)反应10分钟后加入1mlDNS试剂(ml)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至20ml比色以0号管为空白参比，测定540nm处的吸光度记录吸光值（A540）金属离子对酶活性的影响金属离子空白无Zn2+Mg2+Fe2+Cu2+Ca2+Al3+蔗糖溶(ml)(0.2mol/L)00.20.20.20.20.20.20.2各种金属离子00使其终浓度为0.1mmol/L缓冲液(ml)PH52.01.81.81.81.81.81.81.8粗酶液（ul）50水50505050505050反应温度37℃NaOH(1mol/L)(ml)反应10分钟后加入1mlDNS试剂(ml)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至20ml比色空白参比，测定540nm处的吸光度记录吸光值（A540）蔗糖酶的固定化实验四酵母蔗糖酶的改造本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。壳聚糖上的氨基与戊二醛中的一个醛基反应，然后用另一醛基与酶蛋白上的氨基反应。为了评价固定化方法的好坏，需进行酶回收率和酶相对活力的计算。蔗糖酶的固定化1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联（1）称取3g壳聚糖溶于98mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠（2）称取8gNaOH置大烧杯中，加入180mL蒸馏水及20mL甲醇。（3）将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体.（4）壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100mL，静置2h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。蔗糖酶的固定化2.固定化酶的制备（1）将静置2h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。（2）酵母蔗糖酶酶液1mL用蒸馏水稀释至100mL,与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。(3)固定化酶测定前，用蒸馏水洗涤2两次，以除去未固定住的残留酶液.3.固定化酶的评价分别测游离酶、固定化酶以及残留酶液的酶活力。比色管号1空白234蔗糖溶液0ml1ml1ml1ml最适PH缓冲液3ml1ml1ml1ml游离酶/固定化酶01ml游离酶1g固定化酶1ml残留酶液37℃准确反应10min，1mL1mol/LNaOH终止酶促反应水杨酸试剂1ml1ml1ml1ml沸水浴精确反应5min,冷却后定容至20mLA540蔗糖酶的固定化蔗糖酶的修饰N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）能特异地修饰蛋白质分子中色氨酸残基的吲哚基团。若色氨酸残基是酶活性中心的必需基团，那么经NBS修饰后，酶活性丧失的程度与修饰剂的浓度有化学计量关系。比色管号1空白2345678蔗糖酶液（ul）100100100100100100100醋酸buffer（ul）200204060801001mmol/l的NBS（ul）10080604020100NBS终浓度mmol/l010.80.60.40.20137摄氏度水浴修饰20min蔗糖溶液/ul010010010010010010010037摄氏度准确反应10min，100ul1mol/LNaOH终止酶促反应DNS试剂ul100100100100100100100100沸水浴精确反应5min，冷却后加入4.5ml水A540相对活力%（以7号管酶活力为100%）取8只试管，编号，按下表操作：结果分析以NBS浓度为横坐标，相对活力为纵坐标绘制折线图，并分析不同浓度的NBS对酵母蔗糖酶活力的影响，得出结论。