2015-2016学年高中生物专题一基因工程第2课时基因工程的基本操作程序学案新人教版选修3

1第2课时基因工程的基本操作程序[目标导读]1.结合教材P8图1—6，整体把握并说出基因工程的原理和基本操作程序。2.尝试设计某一转基因生物(例如让大肠杆菌生产鼠的β­珠蛋白)的研制过程。[重难点击]基因工程基本操作程序的四个步骤。1．质粒作为载体所具备的条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。2．DNA的复制过程示意图DNA复制是一个边解旋边复制的过程，以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用细胞内游离的四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一段子链，复制结束后，一个DNA分子就形成了两个完全相同的DNA分子。3．基因的表达是指某一基因通过转录、翻译合成相关蛋白质的过程。[课堂导入]抗软化番茄是通过将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞培育而成的，具有抗软化、耐储存的优点，这种技术需要特定的操作程序，今天我们就来学习基因工程的基本操作程序。探究点一目的基因的获取1．目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。2．获取目的基因的常用方法2(1)从基因文库中获取①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。②基因文库种类文库类型部分基因文库(如cDNA文库)基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以(2)利用PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制。②过程：3a．变性：加热至90～95℃，使DNA中的氢键断裂，双链解开。b．复性：冷却至55～60℃，引物与单链相应互补序列结合。c．延伸：加热至70～75℃，在DNA聚合酶的作用下，沿模板延伸子链，最终合成2条DNA分子。③若PCR过程中，扩增循环的次数是n，则目的基因的量将被扩增2n倍。④PCR技术中因为需要在高温下进行，因此需要特殊的热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。(3)人工合成法：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。归纳提炼两种人工合成目的基因的方法的比较(1)反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。其过程如下图：目的基因的mRNA――→反转录单链DNA――→合成双链DNA即目的基因(2)化学合成法：即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。其过程如下图：蛋白质的氨基酸序列――→推测mRNA的核苷酸序列――→推测结构基因的核苷酸序列――→化学合成目的基因(3)由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法。活学活用1．样品DNA经PCR技术扩增，可以获取大量DNA分子克隆。在试管中进行DNA的人工复制(如图)。在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受4限于活动的生物体。据图回答下列问题：(1)PCR技术的原理是____________________，图中A过程表示__________。(2)某样品DNA中共含3000个碱基对，碱基数量满足：(A＋T)∶(G＋C)＝1/2，现欲得到100个与样品相同的DNA，至少需要向试管中加入________个腺嘌呤脱氧核苷酸。(3)A过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达90～95℃时才能完成，说明DNA分子具有________性。利用PCR技术获取目的的基因的前提是______________________________。(4)由图中信息分析可知，催化C过程的酶是________，它与正常细胞里的酶的区别是______________。答案(1)DNA分子半保留复制DNA解旋(2)99000(3)稳定要有一段已知目的基因的核苷酸序列(4)DNA聚合酶能耐高温解析PCR技术是穆里斯等人在1988年发明的，它是利用DNA双链半保留复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数形式增加。其前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温的DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环结合，使目的基因呈指数形式扩增。探究点二基因表达载体的构建和目的基因的导入1．基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。(1)基因表达载体的组成基因表达载体模式图①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA短片段_，位于基因的尾端，使转录在此停止。③标记基因：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而对受体细胞进行筛选。常用的标记基因是抗生素抗性基因。④目的基因：目的基因插在启动子和终止子之间。5(2)构建基因表达载体的过程小贴士切割质粒和目的基因的限制酶一般是同一种酶，以获得互补的黏性末端，利于重组质粒的构建。但是，为了防止目的基因自我环化，实际操作时也可以用两种不同的限制酶同时进行切割，这两种酶切出的黏性末端应相同。终止子是DNA分子上决定转录停止的一段特殊结构的DNA短片段；终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基。2．将目的基因导入受体细胞(1)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。目的基因在受体细胞内的存在形式一般有以下两种：(2)将目的基因导入受体细胞的方法生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→融合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子小贴士农杆菌转化法中有二次拼接和二次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上T­DNA的中间部位，第二次拼接非人工操作指被插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T­DNA进入受体细胞。6归纳提炼限制酶—DNA连接酶—工具酶基因表达载体的构建构件—启动子—目的基因—终止子—标记基因农杆菌转化法—花粉管通道法—植物将目的基因导入受体细胞―→动物显微注射技术微生物氯化钙法活学活用2．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现______________________。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T­DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________(部位)即可。(2)根据T­DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制____________________(酶)合成的基因。(3)图示c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是____________类化合物。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取________________________________。(至少写出两种)答案(1)单子叶植物将目的基因导入植物细胞染色体的DNAT­DNA片段(内部)(2)DNA连接酶、限制酶(3)酚(4)基因枪法、花粉管通道法解析(1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现将目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T­DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T­DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。探究点三目的基因的检测与鉴定7目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。1．目的基因的检测(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因：采用DNA分子杂交技术。主要做法是用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因。显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体DNA中。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA：采用分子杂交技术。具体做法与DNA和DNA分子之间杂交相同，只是它从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与DNA和DNA分子之间杂交相同。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用抗原－抗体杂交法。具体做法是：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达了。2．鉴定观察图示，判断抗虫棉的接种实验属于个体生物学水平鉴定，通过做抗虫(或抗病)的接种实验以确定是否具有抗性及抗性的程度。归纳提炼基因工程中的几个易错点(1)在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。(2)原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。(3)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。活学活用83．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录出mRNA④检测目的基因是否翻译成蛋白质A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④答案C解析目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针与基因组DNA杂交。检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是DNA—mRNA杂交。最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。91．如图为用于基因工程的一个质粒示意图。用EcoRⅠ限制酶切割目的基因和该质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培养基中培养：a—无抗生素的培养基，b—含四环素的培养基，c—含氨苄青霉素的培养基，d—含四环素和氨苄青霉素的培养基。含重组质粒的大肠杆菌能生长的是()A．aB．a和cC．a和bD．b和c答案B2．下列关于基因工程的叙述，正确的是()A．基因工程经常以抗菌素抗性基因作为目的基因B．细菌质粒是基因工程常用的载体C．通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理载体DNAD．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体答案B解析细菌质粒是基因工程常用的载体。基因工程的目的基因是人们所需要的特定基因，可以是抗菌素的抗性基因，也可以是其他基因如抗除草剂基