20151215PEDVPI-N蛋白纯化

PEDVPcordI-N蛋白纯化1.20151213P蛋白纯化：1.1样品处理：取2管保存的菌离（菌液25倍浓缩，2mL每管分装），分别用2mL裂解液（1/1000DTT）将菌离悬浮，每管超声裂解5min，12000rmp离心1min，将上清合并后用终浓度为25%的饱和硫酸铵沉淀（逐滴加入），于4℃冰箱中静置30min后取出离心，12000rmp离心10min，将上清用枪吸出弃掉，沉淀用1/2原体积的裂解液重悬（未加DTT），重悬后超声裂解4-5下至完全透亮，12000rmp离心1min，取上清上样，若仍有沉淀，可将沉淀用少量上清液重悬继续超声裂解。1.2裂解液配制：1.3柱子处理（1mL介质）：将样品与介质混合均匀，置于4℃冰箱挂柱30min,每隔5min颠倒混匀一次，取出后，用流速器限速，收集流穿，并反复挂柱3次（流速慢）。ddH2O20mL0.1MEDTA-Na26mLddH2O20mL1*BB10mL1*Chargebuffer（镍）6mL(流速慢)裂解液/1*BB6-8mLSDS0.1g（1/1000）曲拉通1mL(1/100)NaCl5.8g(1M)Tris0.24g(20mM)定容至100mL,调PH=8.51.4洗涤及洗脱条件：洗涤及洗脱过程中，流速尽量慢。1.5SDS-PAGE蛋白电泳：将样品用4*buffer处理，上样量10uL,用12%的分离胶进行鉴定结果如下：1*BB8-10mL50mM6mL100mM6mL200mM6mL500mM6mL