15第十四章DNA的生物合成

第十四章DNA的生物合成生物体内或细胞内进行的DNA合成主要包括DNA复制、DNA修复合成和逆转录合成DNA等过程。DNA复制（replication)是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。DNA的忠实复制以碱基配对规律为分子基础，酶促修复系统可以校正复制中可能出现的错误。原核生物和真核生物DNA复制的规律和过程非常相似，但具体细节上有许多差别，真核生物DNA复制过程和参与的分子更为复杂和精致。本章主要讨论DNA复制和DNA的逆转录合成，DNA的修复将在下一章叙述。第一节DNA复制的基本特征DNA复制的主要特征包括：半保留复制（semi-conservativereplication)、双向复制（bidire-ctionalreplication）和半不连续复制（semi-discontinuousreplication).。DNA的复制具有高保真性（highfidelity）。一、DNA以半保留方式进行复制DNA生物合成的半保留复制规律是遗传信息传递机制的重要发现之一。在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链。亲代DNA模板在子代DNA中的存留有3种可能性，全保留式、半保留式或混合式（图14-1a）。1958年，M.Meselson和F.W.Stahl用实验证实自然界的DNA复制方式是半保留式的。他280第十四章DNA的生物合成281们利用细菌能够以NH4Cl为氮源合成DNA的特性，将细菌在含15NH4Cl的培养液中培养若干代（每一代约20min)，此时细菌DNA全部是含15N的“重”DNA；再将细菌放回普通的14NH4Cl培养液中培养，新合成的DNA则有14N的掺入；提取不同培养代数的细菌DNA做密度梯度离心分析，因15N-DNA和14N-DNA的密度不同，DNA因此形成不同的致密带。结果表明，细菌在重培养基中生长繁殖时合成的15N-DNA是1条高密度带；转人普通培养基培养1代后得到1条中密度带，提示其为15N-DNA链与14N-DNA链的杂交分子；在第二代时可见中密度和低密度2条带，表明它们分别为15N-DNA链/14N-DNA链、14N-DNA/14N-DNA链的组成的分子（图14-1b)。随着在普通培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带保持不变。这一实验结果证明，亲代DNA复制后，是以半保留形式存在于子代DNA分子中的。半保留复制规律的阐明，对于理解DNA的功能和物种的延续性有重大意义。依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致（图14-2）。遗传的保守性是相对而不是绝对的，自然界还存在着普遍的变异现象。遗传信息的相对稳定是物种稳定的分子基础，但并不意味着同一物种个体与个体之间没有区别。例如病毒是简单的生物，流感病毒就有很多不同的毒株，不同毒株的感染方式、毒性差别可能很大，在预防上有相当大的难度。又如，地球上曾有过的人口和现有的几十亿人，除了单卵双胞胎之外，两个人之间不可能有完全一样的DNA分子组成（基因型）。在强调遗传恒定性的同时，不应忽视其变异性。二、DNA复制从起点向两个方向延伸细胞的增殖有赖于基因组复制而使子代得到完整的遗传信息。原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin)。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制（图14-3a)。复制中的模板DNA形成2个延伸方向相反的开链区，称为复制叉（repli-cationfork）。复制叉指的是正在进行复制的双链DNA分子所形成的Y形区域，其中，已解旋的两条模板单链以及正在进行合成的新链构成了Y形的头部，尚未解旋的DNA模板双链构成了Y形的尾部。282第三篇遗传信息的传递真核生物基因组庞大而复杂，由多个染色体组成，全部染色体均需复制，每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征（图14-3b）。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子（repli-con）。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位。高等生物有数以万计的复制子，复制子间长度差别很大，约在13kb一900kb之间。三、DNA复制反应呈半不连续特征DNA双螺旋结构的特征之一是两条链的反向平行，一条链为5'至3'方向，其互补链是3'至5'方向。DNA合成酶只能催化DNA链从5'至3'方向的合成，故子链沿着模板复制时，只能从5'至3'方向延伸。在同一个复制叉上，解链方向只有一个，此时一条子链的合成方向与解链方向相同，可以边解链，边合成新链。然而，另一条链的复制方向则与解链方向相反，只能等待DNA全部解链，方可开始合成，这样的等待在细胞内显然是不现实的。1968年，冈崎（R.Okazaki）用电子显微镜结合放射自显影技术观察到，复制过程中会出现一些较短的新DNA片段，后人证实这些片段只出现于同一复制叉的一股链上。由此提出，子代DNA合成是以半不连续的方式完成的，从而克服DNA空间结构对DNA新链合成的制约。目前认为，在DNA复制过程中，沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的，这股链称为前导链（leadingstrand)；另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从5'→3'生成引物并复制子链。模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合成另一段子链，这一不连续复制的链称为后随链（laggingstrand）。前导链连续复制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复制（图14-4)。在引物生成和子链延长上，后随链都比前导链迟一些，因此，两条互补链的合成是不对称的。沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazakifragment）。真核冈崎片段长度100~200核苷酸残基，而原核是1000~2000核苷酸残基。复制完成后，这些不连续片段经过去除引物，填补引物留下的空隙，连接成完整的DNA长链。第十四章DNA的生物合成283第二节DNA复制的酶学和拓扑学变化DNA复制是酶促核昔酸聚合反应，底物是dATP、dGTP,dCTP和dTTP，总称dNTP。dNTP底物有3个磷酸基团，最靠近核糖的称为α-P，向外依次为β-P和γ-P。在聚合反应中，α-P与子链末端核糖的3'-OH连接。模板是指解开成单链的DNA母链，遵照碱基互补规律，按模板指引合成子链以及子链延长的方向性。引物提供3'-OH末端使dNTP可以依次聚合。由于底物的5'-P是加合到延长中的子链（或引物）3'-端核糖的3'-OH基上生成磷酸二酯键的，因此新链的延长只可沿5'向3'方向进行。核苷酸和核苷酸之间生成3'，5'-磷酸二酯键而逐一聚合，是复制的基本化学反应（图14-5）。图14-5的反应可简示为：（dNMP）n。+dNTP→(dNMP）n+1+PPi。N代表4种碱基的任一种。一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合DNA聚合酶全称是依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent,DNApolymerase，DNApol）。DNApol是1958年由A.Kornberg在E.coli中首先发现的。他从100kg细菌沉渣中仅提取到了0.5g纯酶，在试管内加入模板DNA、dNTP和引物，该酶可催化新链DNA生成。这一结果直接证明了DNA是可以复制的，是继DNA双螺旋模型确立后的又一重大发现。当时将此酶又称为复制酶（replicase）。在发现其他种类的DNApol后，Kornberg发现的DNA聚合酶被称为DNApolI。（一）原核生物有3种DNA聚合酶大肠杆菌经人工处理和筛选，可培育出基因变异菌株。DNApolI基因缺陷的菌株，经实验证明照样可进行DNA复制。从变异菌株中相继提取到的其他DNApol被分别称为DNApolII和DNApolⅢ。这三种聚合酶都有5'→3'延长脱氧核苷酸链的聚合活性及3'→5'核酸外切酶活性。284第三篇遗传信息的传递DNApolIⅢ的聚合反应比活性远高于poiI，每分钟可催化多至105次聚合反应，因此DNApolⅢ是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNApolⅢ是由10种亚基组成的不对称异聚合体（图14-6），由2个核心酶、1个γ-复合物和1对β亚基构成。核心酶由α﹑ε﹑θ亚基共同组成，主要作用是合成DNA，兼有5ˊ--.3ˊ聚合活性;ε亚基是复制保真性所必需；两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用；其余的6个亚基统称，γ一复合物，包括γ﹑δ﹑δˊψ﹑Χ和τ，有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用。DNApolI的二级结构以α一螺旋为主，只能催化延长约20个核苷酸左右，说明它不是复制延长过程中起主要作用的酶。DNApolI在活细胞内的功能主要是对复制中的错误进行校对，对复制和修复中出现的空隙进行填补。用特异的蛋白酶可以将DNApolI水解为2个片段，小片段共323个氨基酸残基，有5’-3’核酸外切酶活性。大片段共604个氨基酸残基，被称为Klenow片段，具有DNA聚合酶活性和3'-5’核酸外切酶活性。Klenow片段是实验室合成DNA和进行分子生物学研究常用的工具酶。DNApolII基因发生突变，细菌依然能存活，推想它是在州I和间皿缺失情况下暂时起作用的酶。DNApolII对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。框14-1科学之家A.Kornberg因DNA聚合酶的发现，与他以前的导师S.Ocboa发现RNA合成机制，共同获得了1959年的诺贝尔生理／医学奖。在获奖10年书后，人们才知道，他所发现的DNA聚合酶并非细菌真正用于复制DNA的酶，在细胞内执行这个任务的是另一种新发现的酶DNA聚合酶皿。A.Kornb魄发现的醉是DNA聚合酶I，在DNA复制中起对和填补空陈的作用。非常巧合的是，DNA聚合酶班是他的次子—加州大学旧金山分校的生物化学教授T.B.Kornberg在哥伦比亚大学读书时发现的。Kornberg家族是“科学之家”。他的长子—斯坦福大学的R.D.Kornberg由于在真核生物转录酶结构研究中成绩卓越获得了2006年的诺贝尔化学奖；他的妻子也是他的实验助手，他们对酶的研究情有独钟，共发现了30多种酶。他曾写了一本自传式的普及生物化学特别是酶知识的作品，书名就叫《酶的情人》。第十四章DNA的生物合成285（二）常见的真核细饱DNA双合醉有5种真核细胞的DNA聚合酶主要有5种，它们在功能上与原核细胞的比较见表14-1。在真核生物的DNA链延长中起催化作用的主要是DNApolδ，相当于原核生物的DNApolⅢ；此外它还有解旋酶的活性。至于高等生物中是否还有独立的解旋酶和引物酶，目前还未能确定。但是，在病毒感染培养细胞（HeLa/SV40）的复制体系中，发现SV40病毒的T抗原有解旋酶活性。DNApolα催化新链延长的长度有限，但它能催化RNA链的合成，因此认为它具有引物酶活性。DNApolβ复制的保真度低，可能是参与应急修复复制的酶。DNApolε与原核生物的DNApolI相类似，在复制中起校对修复和填补引物去除后缺口的作用。DNApolγ是线粒体DNA复制的酶，见本章第四节。二、DNA聚合醉的碱基选择和校对功能实现复制的保真性DNA复制的保真性是遗传信息稳定传代的保证。生物体至少有3种机制实现保真性：①遵守严格的碱基配对规律；②聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；③复制出错时有即时的校对功能。（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择DNA复制保真的关键是正确的碱基配对，而碱基配对的关键又在于氢键的形成。G和C以3个氢键，A和T以2个氢键维持配对，错配碱基之间难以形成氢键。除化学结构限制外，DNA聚合酶对碱基配对具有选择作用。DNApol是在原核生物DNA链延长中起催化作