17第十六章RNA的生物合成

第十六章RNA的生物合成1961年S.B.Weiss和J.Hurwitz等各自在大肠杆菌裂解液中发现了DNA依赖的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase,RNApol)。在此之前S.Ochoa已经提出了RNA的转录机制，并因此获得1959年度诺贝尔生理／医学奖。生物体以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription），意指将DNA的碱基序列转抄为RNA。DNA分子上的遗传信息是决定蛋白质氨基酸序列的原始模板，mRNA是蛋白质合成的直接模板。通过RNA的生物合成，遗传信息从染色体的贮存状态转送至胞质，从功能上衔接DNA和蛋白质这两种生物大分子。1958年，F.Crick将上述遗传信息的传递方式归纳为中心法则（centraldogma)。1970年H.Temin发现了逆转录现象，对中心法则进行了补充。在生物界，RNA合成有两种方式。一是DNA指导的RNA合成，也称转录，为生物体内的主要合成方式。转录产物除mRNA,rRNA和tRNA外，在真核细胞内还有snRNA,miRNA等非编码RNA。对RNA转录过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变，并由此而引发一系列细胞功能变化。因此，理解转录机制对于认识许多生物学现象和医学问题具有重要意义。mRNA转录过程及其加工和剪切错误可引起疾病。RNA的转录合成是本章的主要内容。另一种是RNA依赖的RNA合成（RNA-dependentRNAsynthesis），也称RNA复制（RNArep-lication)，由RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase）催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式，限于篇幅本章未予叙述。转录和复制都是酶促的核昔酸聚合过程，有许多相似之处。它们都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核昔酸之间生成磷酸二醋键；都从5’向3’方向延长聚核昔酸链；都遵从碱基配对规律。但相似之中又有区别（表16-1）。第一节原核生物转录的模板和酶RNA的生物合成属于酶促反应，反应体系中需要DNA模板,NTP,RNApol,其他蛋白因子及Mg2+和Mn2+等。合成方向5'→3'，核昔酸间的连接方式为3'，5'一磷酸二酯键。312第十六章RNA的生物合成313一、原核生物转录的模板在DNA分子双链上，按碱基配对规律能指导转录生成RNA的一股链作为模板指导转录，另一股链则不转录，这种模板选择性称为不对称转录（asymmetrictranscription）。用RNA对DNA的核酸杂交法（见第二十章）或做DNA、RNA碱基序列测定比较，都可证明DNA分子上的一个基因只有一股链可转录生成其编码产物（图16-1a)。作为一个基因载体的一段DNA双链片段，转录时作为RNA合成模板的一股单链称为模板链（templatestrand），相对应的另一股单链被称为编码链（codingstrand）。转录产物若是mRNA，则可用作翻译的模板，决定蛋白质的氨基酸序列（图16-lb）。模板链既与编码链互补，又与mRNA互补，可见mRNA的碱基序列除用U代替T外，与编码链是一致的。文献刊出的各个基因的碱基序列，为避免烦琐和便于查对遗传密码，一般只写出编码链。二、RNA聚合酶催化RNA合成（一）RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成DNA依赖的RNApol催化RNA的转录合成。该反应以DNA为模板，以ATP、GTP、UTP和CTP为原料，还需要Mg2+和Zn2+作为辅基。RNA合成的化学机制与DNA的复制合成相似。RNApol通过在RNA的3'-OH端加入核苷酸，延长RNA链而合成RNA.。3'-OH在反应中是亲核基团，攻击进入的核苷三磷酸的α-磷酸，并释放出焦磷酸，总的反应可以表示为：（NMP)n+NTP→（NMP）n＋1+PPi。RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。新加入的核苷酸以Watson-Crick碱基配对原则和模板的碱基互补。前述的DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要RNA引物存在，而RNA聚合酶能够直接启动转录起点处的两个核苷酸间形成磷酸二酯键（图16-2），因而RNA链的起始合成不需要引物。（二）RNA聚合酶由多个亚基组成大肠杆菌（E.coli）的RNA聚合酶是目前研究得比较透彻的分子。这是一个分子量达480kDa,由4种亚基α2(2个α)、β、β’和σ组成的五聚体蛋白质。有证据表明，大肠杆菌RNA聚合酶还有第五种亚基（w亚基）存在，其功能不详，本章不予赘述。其他各主要亚基及功能见表16-2。314第三篇遗传信息的传递大肠杆菌RNApol的4个主要亚基（α2ββ’）称为核心酶（coreenzyme）。体外或称试管内转录（invitrotranscription）实验（含有模板、酶和NTP)证明，核心酶能独立催化模板指导的RNA合成，但合成RNA时没有固定的起始位点。加入了σ亚基的酶才能在DNA的特定起始点上起始转录，可见σ亚基的功能是辨认转录起始点。σ亚基与核心酶共同称为全酶。细胞内的转录起始需要全酶。转录延长阶段则仅需核心酶。图16-3示RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合。大肠杆菌内有一些不同的RNApol全酶，其差异是σ亚基的不同。目前已发现多种σ亚基，并用其分子量命名区别，最常见的是σ70(分子量70kDa)。σ70是辨认典型转录起始点的蛋白质，大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有σ70因子的全酶所识别并激活第十六章RNA的生物合成315将细菌从通常培养的37℃升温至42℃，细菌可迅速增加一套共17种蛋白质的合成。这些蛋白质被称为热激蛋白（heatshockproteins,HSP)。当温度升至50℃，大部分蛋白质合成已停止，HSP却能继续合成。HSP的编码基因称为热激基因（hsp）。hsp基因的转录起点的上游序列与其他基因不同，因而需另一种σ因子，即σ32（分子量32kDa)辨认及启动其转录。可见，σ32是应答热刺激而被诱导产生的，它本身也属于一种Hsp。框16-1RNA聚合酶的发现早在1955年，M.Grunberg-Manago和S.Ochoa就已报道分离出了催化合成RNA的酶，尽管人们随后发现他们分离得到的酶是多聚核苷磷酸化酶，但是他们发现的酶在M.Nirenberg和J.H.Matthaei合成第一个遗传密码子中发挥了重要作用。S.Ochoa因阐明RNA生物合成机制而获得了1959年诺贝尔生理学／医学奖。1959年，美国科学家J.Hur-witz在大肠杆菌的抽提液中分离得到了真正的RNA聚合酶。与此同时，S.B.Weiss在大鼠肝细胞核提取物中也发现了参与RNA合成的物质。他们发现，提纯的RNA聚合酶在体外能够以DNA为模板，在加入ATP、GTP、CTP、UTP及Mg2+等后合成RNA，合成的RNA与DNA模板链完全互补。其他原核生物的RNApol在结构和功能上均与大肠杆菌相似。抗生素—利福平（rifampi-cin)或利福霉素可以特异抑制原核生物的RNApol，成为抗结核菌治疗的药物。它专一性地结合RNA聚合酶的β亚基。若在转录开始后才加入利福平，仍能发挥其抑制转录的作用，这说明β亚基是在转录全过程都起作用的。三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录对于整个基因组来讲，转录是分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子（operon）（第十八章）。操纵子中包括了若干个基因的编码区及其调控序列。调控序列中的启动子（promoter）是RNApol结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物是以RNApol全酶结合到启动子上而启动转录的，其中由σ亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。启动子结构的阐明回答了转录从哪里起始这一问题，是转录机制研究的重要发现。研究中采用了一种巧妙的方法，即RNA聚合酶保护法。在实验中，先将提取的DNA与提纯的RNA聚合酶混合温育一定时间，再加入核酸外切酶进行反应。结果显示，大部分DNA链被核酸酶水解为核苷酸，但一40~6bp的DNA片段被保留下来。这段DNA没有被水解，是因为RNA聚合酶结合在上面，因而受到保护。受保护的DNA位于转录起始点的上游，并最终被确认为是被RNA聚合酶辨认和紧密结合的区域，是转录起始调节区（图16-4）。对数百个原核生物基因操纵子转录上游区段进行的碱基序列分析，证明RNA聚合酶保护区存在共有序列。以开始转录的5’-端第一位核苷酸位置转录起点（transcriptionstartsite，TSS;或initiator）为+1，用负数表示其上游的碱基序号，发现-35和-10区A-T配对比较集中。-35区的最大一致性序列是TTGACA。-10区的一致性序列TATAAT，是1975年由D.Pribnow首先发现的，故称为Pribnow盒（Pribnowbox）。-35与-10区相隔16~18个核苷酸，-10区与转录起点相距6或7个核苷酸。A-T配对相对集中，表明该区段的DNA容易解链，因为A-T配对只有两个氢键维系。比较RNApol结合不同区段测得的平衡常数，发现RNApol结合在-10区比结合在-35区更为牢固。从RNApol分子大小与DNA链长的比较，可确定其结合DNA链时分子的跨度。这些结果都能推论出：-35区是RNApol对转录起始的识别序列（recognitionsequence）。结合识别序列后，酶316第三篇遗传信息的传递向下游移动，达到Pribnow盒，酶形成相对稳定的酶一DNA复合物，就可以开始转录。第二节原核生物的转录过程原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。一、转录起始需要RNA聚合酶全酶转录全过程均需RNApol催化，起始过程需核心酶，由σ亚基辨认起始点，延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。简言之，转录起始就是RNApol在DNA模板的转录起始区装配形成转录起始复合体，打开DNA双链，并完成第一和第二个核昔酸间聚合反应的过程。转录起始复合物中包含有RNApol全酶、DNA模板和与转录起点配对的NTPs。起始阶段的第一步是由RNApol识别并结合启动子，形成闭合转录复合体（closedtranscriptioncomplex），其中的DNA仍保持完整的双链结构。原核生物需要靠RNApol中的σ亚基辨认转录起始区和转录起点。首先被辨认的DNA区段是-35区的TTGACA序列，在这一区段，酶与模板的结合松弛；接着酶移向-10区的TATAAT序列并跨过了转录起点，形成与模板的稳定结合。起始的第二步是DNA双链打开，闭合转录复合体成为开放转录复合体（opentranscriptioncomplex)。开放转录复合体中DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始。无论是转录起始或延长中，DNA双链解开的范围都只在17bp左右，这比复制中形成的复制叉小得多。起始的第三步是第一个磷酸二酯键的形成。转录起始不需引物，两个与模板配对的相邻核苷酸，在RNApol催化下生成磷酸二酯键。转录起点配对生成的RNA的第一位核苷酸，也是新合成的RNA分子的5’-端，总是GTP或ATP，又以GTP更为常见。当5'-GTP与第二位的NTP聚合生成磷酸二酯键后，仍保留其5’端3个磷酸基团，生成聚合物是5'-pppGpN-OH3’，其3’端的游离羟基，可以接收新的NTP并与之聚合；使RNA链延长下去。RNA链的5’-端结构在转录延长中一直保留，至转录完成。二、RNApol核心酶独立延长RNA链第一个磷酸二酯键生成后，转录复合体的构象发生改变，σ亚基从转录起始复合物上脱落，并离开启动子，RNA合成进人延长阶段。此时，仅有RNApol的核心酶留在DNA模板上，并沿第十六章RNA的生物合成317DNA链不断前移，催化RNA'链的延长。实验证明，σ亚基若不脱落，RNApol则停留在起始位置，转录不继续进行。化学计量又证明，每个原核细胞，RNApol各亚基比例为:α:β:β:σ=4000:2000：2000：6