1液相色谱基础理论

液相色谱原理应用尚飞液相色谱基础知识部分•液相色谱简介•液相色谱理论基础高效液相色谱简介色谱的发明人•俄国科学家：M.S.Tswett•正式命名“色谱”的文献经典液相色谱ReviewStop叶绿素中的有色物质石油醚淋洗剂叶绿素碳酸钙颗粒色谱法简介•色谱法（Chromatography）溯源•俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献•1906年正式命名（见诸文献）•色谱法；Chromatography•50年代开始广泛研究和应用•主要是气相色谱及薄层色谱•高效液相色谱法的广泛应用始于70年代什么是高效液相色谱•HighPerformanceLiquidChromatography•高效液相色谱法，简称：HPLC•是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段：•高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器……•在技术，理论及应用上处于迅速发展阶段应用领域食品、饮料化工生物技术、医药环境应用领域……HPLC技术的发展趋势•高速化、高效化•高精度的高压泵、能走梯度洗脱；•高灵敏度的检测器、紫外/可见光检测器,二极管阵列检测器（DAD），荧光检测器，电喷雾检测器（CAD）以及示差、蒸发光散射检测器等。•微粒硅胶为LC发展奠定了基础，现在的填料粒度大多为10µm、5µm甚至3µm、亚2µm，填料的微粒化产生了快速柱，微粒柱提高了分离效率和分析速度。•键合相填料的出现拓宽了LC在多领域的实用能力。•微径柱，毛细管柱，Nano柱提高灵敏度和分离效率•特种柱，专用柱增强了色谱分离的选择性HPLC技术的发展趋势•自动化、智能化•由色谱工作站单点控制泵、自动进样器、检测器的操作程序并作色谱数据处理和光谱信息处理，从而实现24小时无人操作。•二极管阵列检测器的作用可在色谱分析的同时作光谱确认•HPLC与质谱仪的联用技术液相色谱系统：总体设计•••••泵（含脱气机）自动进样器色谱柱（放于柱温箱中）检测器系统控制软件（电脑）控制软件泵自动进样器色谱柱检测器ThermoUltiMate3000仪器配置梯度泵独特的柱温箱可放置两个柱切换阀脱气机和溶剂架带温控选项的自动进样器可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器高效液相色谱基础理论色谱分离过程流动相色谱柱流动相流动方向色谱分离过程固定相固定相根据不同的相互作用原理和强度保留分析物由于不同化合物与固定相和流动相之间的相互作用强度和机理不同，所以当化合物流经色谱柱时就会被分分开。3631-5,,5732-68,8633-84-12,930液相色谱图简介600140,01-Parabene_Summit_07102-Parabene_Summit_0710mAUUV_VIS_Pump_PressbarParabeneisocratic70BSumParabeneisocratic70BSum保留时间检测器信号峰高压力信号及波动100500400300200130,0120,0110,0峰面积-5090,0100,0min12Methanol:70,0%Flow:0,50ml/min%D:0,0%%C:0,0%基线0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,010,011,012,013,014,015,015色谱图：即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。基础理论：术语介绍•色谱峰－Peak•色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线•峰底－PeakBase•峰的起点与终点之间连接的直线•峰高－PeakHeight•峰最大值到峰底的距离•峰宽－PeakWidth•在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离•半（高）峰宽－PeakWidthatHalfHeight•通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离基础理论：术语介绍•峰面积－PeakArea•峰与峰底之间的面积,又称响应值•标准偏差；σ－StandardError•0.607倍峰高处所对应峰宽的一半•拖尾峰－TailingPeak•后沿较前沿平缓的不对称峰•前伸峰－LeadingPeak•前沿较后沿平缓的不对称峰•鬼峰－GhostPeak•并非由试样所产生的峰；亦称假峰基础理论：术语介绍•基线－Baseline•在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线•基线飘移－BaselineDrift•基线随时间定向的缓慢变化•基线噪声；N－BaselineNoise•由各种因素所引起的基线波动•谱带扩展－BandBroadening•由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象基础理论：术语介绍•死时间，t0－Deadtime•不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间•保留时间，tR－Retentiontime•组分从进样到出现峰最大值所需的时间•调整保留时间，t’R－Adjustretentiontime•保留时间减去死时间•死体积，V0－Deadvolume•不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积•保留体积，VR－Retentionvolume•组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积•调整保留体积，V’R－Adjustretentionvolume•保留体积减去死体积不对称因子计算示意图峰高EP/USP标准：AIA标准：LWRWLW10%LW5%RW10%RW5%A=0.95~1.05：正常峰A0.95：前延峰A1.05：拖尾峰色谱的分离度色谱峰的完全分离是每一个色谱方法的目标。分离度方程•k’是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱•α是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素•N是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度基础理论：塔板理论固流动塔板模型假设色谱柱是由大量分离层构成的，这些分离层称之为理论塔板这些塔板实际是不存在的，他们只是一种假设用来帮助描述色谱柱里所发生的一切定相相在这些塔板里面，固定相和流动相之间存在着一种平衡分析物在这种平衡里面存在着一种平衡系数K，定义为：K=C固定相/C流动相随着K的增加，分析物从色谱柱中的流出时间就越长，即分析物的在色谱柱内的保留时间越长concenntration塔板理论数与柱效的关系•理论塔板数用来衡量色谱柱质量好坏•理论塔板数(N)：理论塔板数越高，柱效越高或者•理论塔板高度(H)：理论塔板高度越大，柱效越低•高柱效色谱柱比低柱效色谱柱在同一保留时间峰更窄•理论塔板数越高，柱效越高whwh色谱柱长time(length)LHN=理论塔板数理论塔板高度t=0246810•常用k’值范围改变k’值的方法调节流动相的极性（比例）、pH、容量因子对分离度的影响't0ttR=k'=固定相流动相tR-t0t0•k’值小•组分流出快，接25tR近死时间•分离度差•k’值大•分离度好•k’值更大•保留时间更长•峰会展宽，损失20151050minutes灵敏度•2k’10,离子强度;梯度淋洗选择因子对分离度的影响==tR2tR1''ttR2R1tR2-t0tR1-t02520可以通过以下途径改变α：15••••改变固定相改变流动相或离子强度改变柱温改变化合物电离状态028104minutes61050÷t0tR2选择性是分离度的关键R–分离度N–理论塔板数α–选择性k’–容量因子例如:在5-m,150mmC18色谱柱上分离一对峰,假如N=10,000塔板/柱,k’1且α=1.01Rs=1若将R提高到2，以达到基线分离方法1–增加N方法2–提高α需要提高N6400%（N=640,000）需要提高α1%（α=1.02）提高分离度最有效的方法就是更换不同固定相类型的色谱柱Rs与N、K′及的关系图示液相色谱应用技术戴安中国有限公司使用文献方法注意点•色谱柱填料的种类、品牌是否相同?•注意文献方法的流动相•是否损害色谱柱?•如色谱填料品牌不同，需要调整流动相•注意色谱柱的规格：内径、柱长•需要调整流速、进样量•注意梯度条件•了解系统的滞后体积（梯度）如何建立一个HPLC方法－必须具备如下条件•流动相类型•运行程序•梯度方法•等度方法•流速•进样量•色谱柱及柱温•检测器完整的HPLC方法（色谱条件）－所需的基本方法参数•液相色谱实验所需的基本参数••••••检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相：种类及配比，等度或梯度流动相输送系统参数：流速温度控制进样量方法参数的选择及其影响方法参数的选择及其影响•选择HPLC检测器•选择合适的色谱柱•反相色谱常用流动相一）选择HPLC检测器•没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！•HPLC检测器可以分为：•溶质性质检测器（选择型）•对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）•整体性质检测器（通用型）•不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）选择液相色谱的检测器通用检测器灵敏度线性范围流速敏感温度敏感破坏性选择性检测器灵敏度线性范围流速敏感温度敏感破坏性RIug104是是否ABSng105否否否ELSDng否否否是FLpg103否否否CADng104否否是ECfg106是是是Condpg105是是否MSpg103是是是理想的HPLC检测器•高灵敏度；可忽略基线噪音•宽的线性范围•对压力、温度及流速等变化不敏感•长时间操作的稳定性•低死体积•非破坏性•选择性6:1灵敏度：信噪比•灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）•检测限（LOD）：S/N=3•定量限（LOQ）：S/N=10•好的信噪比有利于：S•更好的色谱峰确认•更好的定量•更好地完成色谱峰纯度/均一性N选择液相色谱的检测器要考虑的因素：•你要分离的化合物/样品的化学特性•化学结构、分子量及紫外光谱等等•流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）•梯度还是等度•灵敏度需求•采样频率•是否有双检测的需求吸光度（UV/Vis）检测原理•原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收•定量基础：比耳定律，A＝KCL•优点：1）对温度和流速不敏感2）可用于梯度洗脱3）灵敏度较高，ng级检测•缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质吸光度（UV/Vis）检测的应用•大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器•多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（包括紫外/可见检测器和二极管阵列检测器DAD）光电二极管矩阵（PhotoDiodeArray）PhotoDiodeArray简称：PDA或DAD光电二极管矩阵检测器（DAD）的特点和用途•一种三维水平的吸光度检测器－采集三维谱图兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息••在收集色谱图的同时，得到光谱图•提供许多有用的功能•色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认•可以发现单波长检测时未测到的峰•任意波长的色谱再处理•光谱信息•光谱库的建立检索和拟合荧光（Fluorescence）检测原理•原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象即荧光•优点：荧光检测器灵敏度高,pg级检测•缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生荧光检测器原理多环芳烃（PAH）荧光检测器的应用•环境中的污染物•多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等•食品、饮料CH3H3CCH3CH3•食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素OH维生素•染料•维生素及衍生氨基酸•生物技术及制药OOCH3OOOOONHCH3H3COCH3O黄曲霉毒素CH3氨基甲酸酯类杀虫剂示差折光（RefractiveIndex）检测•示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）•通常被认为是一种通用检测器•检测溶液中所有被溶解的溶质－非特异性•任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值SR示差折光（RI）检测的原理•原理：连