1蛋白(血清尿脑脊液等)电泳新技术与临床应用

蛋白（血清、尿、脑脊液等）电泳新技术与临床应用朱立华北京大学第一医院检验科，北京100034自从1937年瑞典科学家Tiselius教授利用U型管建立了移界电泳并用以分离血清蛋白，而且获得很好的电泳分析效果以来，电泳技术已使与各种体液蛋白质（如血清/血浆、尿、脑脊液等）的研究得到极好的发展。特别是近30年来，随着各种新的电泳技术的出现，各种电泳分析仪器与装置的问世，并被引入临床实验室，为临床疾病的诊治提供了新的手段，正发挥着越来越重要的作用。1血清蛋白电泳血清（血浆）蛋白是由来源不同、功能各异的许多蛋白混合组成，可通过蛋白电泳将其分类，并对多种疾病进行诊断和临床疗效观察。1.1血清蛋白电泳的方法1.1.1醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的拖尾现象，且分离速度快，电泳时间短，加样体积少至0.1μl、仅含5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。目前醋酸纤维素薄膜电泳除采用手工方法外，意大利Interlab公司生产了Microtech全自动电泳系统。将常规醋酸纤维素薄膜电泳工作全部自动化，提高了检测结果的准确性和重复性，消除了人为因素的干扰。1.1.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于蛋白质、免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。常用于血清蛋白质、LDH、CK等同工酶的检测。目前临床上常用的自动化检测方法多采用固相的琼脂糖凝胶电泳。最常用的仪器是美国Helena公司和法国Sebia公司的自动电泳仪。产品化的琼脂糖凝胶板包含了电泳缓冲系统，检测极为方便。分辨率高，速度快，无拖尾现象，灵敏度和重复性都很好。1.2电泳结果血清蛋白电泳时，由于各种蛋白质等电点不同，在同一pH下所带电荷量多少有差异，因而在同一电场中泳动速度不同，在载体上可将蛋白质从正极到负极分离为A1b、α1、α2、β、γ球蛋白5个区带，有时还可见到前白蛋白区带，β区带又可分为β1、β2区带。从阳极到阴极，电泳区带及其主要成分如下：前白蛋白区：前白蛋白（PreA）白蛋白区：白蛋白（Alb）α1球蛋白区：α1脂蛋白（α1LP）、α1酸性糖蛋白（α1-AG）、α1抗胰蛋白酶（α1-AT）、α1抗糜蛋白酶（α1-AC）、C1脂酶抑制物(C1Inh)α1-α2球蛋白区：GC糖蛋白（GC）、铜蓝蛋白（Cer）α2球蛋白区：α2巨球蛋白（α2M）、胆碱酯酶（Che）、结合珠蛋白（Hpt）、α2脂蛋白（α2LP）β1球蛋白区：β脂蛋白（βLP）、运铁血红素（HPX）、转铁蛋白（Tf）、C反应蛋白（CRP）β2球蛋白区：纤维蛋白原（Fibr）、抗凝血酶-III(AT-III)、纤溶酶原（PI）、因子B(FB)、补体C1q、C1r、C1s、C3、C4、C5γ球蛋白区：免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG、IgMF-11.3电泳中重要的蛋白质1.3.1前白蛋白由肝细胞合成，与白蛋白抗原性一致，分子量小，电荷量大，移动速度最快。部分正常人可出现前白蛋白带。可与甲状腺素结合称甲状腺素结合性前白蛋白；也可与维生素A结合蛋白络合，起运输维生素A作用。降低见于严重肝病，营养不良。1.3.2白蛋白由肝细胞合成，占总蛋白60%左右。降低见于生成减少（肝病）、丢失过多（肾病）、球蛋白合成增加（见后）。1.3.3α1抗胰蛋白酶血清中有许多蛋白酶，他们由肝细胞合成或由损伤的细胞及感染的生物病原体释放。这类酶统称为胰蛋白酶类酶。同样机体为对抗其异常作用，血清中还存在抗蛋白酶系统，这些抗酶蛋白90%为位于α1球蛋白区，其余位于α2球蛋白区。主要作用：调节内源性蛋白水解，维持内环境稳定。为急性时相反应蛋白，各类急性炎症、感染、组织损伤、坏死、恶性肿瘤、口服避孕药时增高；重症肝病、遗传性α1抗胰蛋白酶缺乏症降低。1.3.4α2巨球蛋白血清中最大的非免疫球蛋白，维持胶体体渗透压，与蛋白酶共价结合使之失活，并促进单核巨噬细胞吞噬。增加见于肾病综合征、其他肾病、巨球蛋白血症、血色病、肝硬化、口服避孕药。1.3.5结合珠蛋白为α2球蛋白主要成分，肝脏合成，与血红蛋白结合。血管内溶血时迅速降低，同时伴有游离血红蛋白升高；急性时相反应时升高。1.3.6铜蓝蛋白位于α2球蛋白区，肝脏合成，为铜氧化酶，血清中90%铜与之结合。肝豆状核变性时水平下降，伴有尿液和肝活检铜增加。1.3.7转铁蛋白为主要的β球蛋白，肝脏合成，在组织间转送铁。缺铁性贫血、肝细胞坏死时升高；肾病、肝硬化、溶血性贫血、慢性感染、白血病、遗传性转铁蛋白缺乏症时减少。1.3.8血红素结合蛋白位于β球蛋白区，肝细胞合成，与高铁血红素结合，使带铁原子的卟啉不被排泄，保存体内铁。早期溶血时降低。1.3.9C反应蛋白位于β、γ之间，肝细胞合成的非抗体免疫性物质，激活补体、促进白细胞运动和对细菌的吞噬、抑制血小板聚集和血块收缩作用。为急性时相反应蛋白。1.3.10免疫球蛋白为多克隆球蛋白，包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。主要位于γ区，IgA常位于β区或紧随其后。升高见于各类慢性感染、自身免疫病、多发性骨髓瘤等；减低见于先天性低或无γ球蛋白血症。1.4主要疾病血清蛋白电泳变化表电泳图形总蛋白白蛋白α1α2βγ主要疾病低蛋白血症型↓↓↓↓N,↑N,↓↓↓(N)营养不良、吸收不良、非选择性蛋白漏失选择性蛋白漏失型↓↓↓↓↑↑↓（N,↑）N,↓肾病综合征重症肝损伤型↓,N↓↓↓↓↓↑重症肝炎肝硬化型↓,N,↑↓↓↓βγ桥↑,↑↑肝硬化急性炎症型↓,NN,↓↑N↑,NN,↑急性感染慢性炎症型↓,N,↑↓↑↑↑,↓↑↑慢性感染、风湿病多克隆高球蛋白血症型↓,N,↑↓↑↑↑慢性感染、风湿病单克隆高球蛋白血症型M蛋白峰良、恶性M蛋白血症、多发性骨髓瘤、F-2重链病高β脂蛋白血症型NN↑↑↑N高脂血症妊娠↓↓↑↑妊娠无白蛋白血症↓↓↓↓↓↓NNNN无白蛋白血症无α1球蛋白血症N↓NNNα1球蛋白缺乏症无β球蛋白血症N,↓↓↓β球蛋白缺乏症无γ球蛋白血症↓↓NNNN↓↓↓IgG缺乏症2尿蛋白电泳2.1概论肾脏是人体重要的排泄器官。肾单位是肾脏的基本功能单位，两侧肾脏大约有200万个肾单位，肾单位由肾小球、小球囊腔、近曲小管、髓袢和远曲小管组成。肾小球为血液滤过器，每天流经血量约1600L，原尿通过近曲、髓袢和远曲小管被重吸收，形成约1~2L/24h终尿排至体外。肾小球滤过膜分为3层，即内皮细胞、基底膜、上皮细胞层。滤过膜具有分子大小的孔径选择性屏障和电荷选择性屏障作用。孔径选择性屏障是由滤过膜的三层细胞间缝隙构成，其内皮细胞间隙窗直径40~100nm，上皮细胞伸出许多伪足敷衍于基底膜上称为足宾（footprocess），两相邻足突间的裂隙孔直径为25~50nm。在正常生理条件下，使中分子以上的蛋白质绝大部分不能通过滤过膜，少量选择性被滤过的微量蛋白又被肾小管重吸收或分解：正常人尿蛋白含量极微(30mg/24hr)，而微量蛋白中的各组份仅为微克或毫克水平。2.2肾脏损伤和蛋白尿分类在各种致病因子作用后，肾小球滤过膜的孔径屏障和电荷屏障受到不同程度损伤。使血浆中蛋白质经肾小球滤出增加；肾小管受损后，重吸收蛋白质减少；肾结构破坏﹣组织蛋白释放增加，均可使尿液中蛋白质浓度升高，形成蛋白尿。尿蛋白产生机制大致可分为肾小球性、肾小管性、混合性、分泌性和组织性等类型，临床最为常见的是肾小球性、肾小管性两种。蛋白尿分类如下：2.2.1生理性蛋白尿或无症状性蛋白尿指由于各种体内外环境因素对机体的影响而导致的尿蛋白含量增多，主要是由肾小球滤过而未被重吸收的蛋白质加上肾或泌尿生殖道分泌的蛋白质共同组成，主要成分为白蛋白。可分为功能性蛋白尿及体位性蛋白尿。2.2.1.1功能性蛋白尿指机体由于剧烈运动、发热、低温刺激、精神紧张、交感神经兴奋等所致的暂时性、轻度的蛋白尿。其形成机制可能与上述原因造成肾血管痉挛或充血而使肾小球毛细血管壁的通透性增加所致。当诱发因素消失，尿蛋白也迅速消失。功能性蛋白尿的蛋白定性一般不超过（+），蛋白定量小于0.5g/24h，多见于青少年。2.2.1.2体位性蛋白尿或直立性蛋白尿指由于直立体位或腰部前突时引起的蛋白尿。其特点为卧床时尿蛋白定性为阴性，起床活动若干时间后即可出现蛋白尿，尿蛋白定性可达（2+）甚至（3+），而平卧后又转成阴性，常见于青少年，可随年龄增长而消失。此种蛋白尿发生机制可能与直立时前突的脊柱压迫肾静脉，或直立位时肾的位置向下移动，使肾静脉扭曲而致肾脏处于淤血状态以及淋巴、血流受阻有关。2.2.2病理性蛋白尿可分为肾前性、肾性和肾后性蛋白尿。2.2.2.1肾前性蛋白尿多为溢出性蛋白尿，是由于血液流经肾脏前的疾病引起。这些疾病导致血循环中某些低分子蛋白质异常增多，因而肾小球滤过亦增加，超过肾小管阈值，尿中出现大量低分子量蛋白质。如Bens-Jonsprotein（BJP，本周蛋白）重链蛋白或其他免疫球蛋白的碎片，肌红蛋白及血红蛋白等。BJP为免疫球蛋白轻链，为肿瘤性浆细胞过量制F-3造，其单体和二聚体均可自由通过肾小球滤膜，当超过肾小管重吸收极限时，自尿中排出。见于多发性骨髓瘤、轻链病和原发性巨球蛋白血症。肌红蛋白于骨骼肌严重损伤或急性大面积心肌梗死时出现于尿中，血红蛋白见于各种原因引起的急性血管内溶血病人尿中。2.2.2.2肾性蛋白尿见于肾小球或肾小管疾病，可因炎症、血管病、中毒等原因引起。①肾小球性蛋白尿：因炎症、免疫等因素的损害，导致肾小球滤膜损伤，孔径增大；肾小球毛细血管壁通透性增加，肾小球滤膜各层，特别是足突细胞层的唾液酸减少或消失，以至静电屏障作用减弱。血浆蛋白，其中70%～80%是白蛋白大量进入Bowman囊，超过近端肾小管对蛋白质的重吸收能力所致的蛋白尿。以白蛋白增多为主，β2微球蛋白正常或轻度增多，尿蛋白含量常≥2g/24h（小儿≥40mg/m2/h）。由于肾小球滤膜病变程度不同而漏出的蛋白质分子量也有相应的变化。早期肾小球滤膜小微孔孔径扩大，中等分子量的蛋白质滤出增加，尿中以白蛋白为主。晚期肾小球滤膜增厚变性，小微孔减少或消失，大微孔增大增多，大分子蛋白质漏出增加。主要见于各类肾小球疾病，如急性肾小球肾炎、肾缺血、缺氧、淤血、淀粉样变；某些继发性肾脏改变，如血管病变、糖尿病性肾病、系统性红斑狼疮肾病。②肾小管性蛋白尿因炎症或中毒引起近曲小管对低分子量蛋白质重吸收功能减退而致的蛋白尿，以β2-微球蛋白（MW11.8KD）、α1-微球蛋白（MW30KD）、视黄醇结合蛋白（RBP，MW21KD）、溶菌酶、claracell蛋白（cc16，MW16KD）等增多为主。单纯性肾小管性蛋白尿，尿蛋白含量较低，一般1g/24h尿（小儿40mg/m2/h）。常见于肾盂肾炎、间质性肾炎、肾小管性酸中毒、重金属(汞、镉、铋)中毒，应用庆大霉素、多粘菌素B及肾移植术后发生排异反应等。③混合性蛋白尿指肾脏病变同时累及肾小球和肾小管而导致的蛋白尿。如肾小球损伤较轻,以4～9万的中分子量蛋白尿为主时，称选择性蛋白尿。病变加重，大分子量蛋白如IgG、IgA甚至IgM也漏出时，则称为非选择性蛋白尿。可通过测定尿中A/G比值粗略地加以鉴别。当比值5时为选择性蛋白尿，表示病变不甚严重，此种肾病综合征对类固醇激素疗效好；反之为非选择性蛋白尿，尿中低分子量的蛋白质和中分子量的白蛋白同时增多，严重时还可见到大分子量免疫球蛋白。见于慢性肾小球肾炎和慢性肾盂肾炎等。④组织性蛋白尿正常人肾小管代谢产生的蛋白质，如sIgA和THP等，每日排出量约为20mg。由于炎症或药物等刺激致使肾小管分泌或破坏解离的蛋白质增多时，这类蛋白质排出增加而形成组织性蛋白尿。见于肾小管炎症、中毒等。此类蛋白质的增加也是疾病状态下形成管型和结石的条件之一。2.2.2.3肾后性蛋白尿多为偶然性蛋白尿。原因是尿中混有多量血、脓、粘液等成分而导致尿蛋白定性阳性。主要见于泌尿道炎症、出血，或阴道分泌物、精