20-1成都医学院大学生创新创业训练计划申报书(创新训练项目)-李建龙

1大学生创新创业训练计划申报书（创新训练项目）项目名称：枯草芽孢杆菌产邻苯二甲酸二丁酯降解酶的研究申请者：何圆联系电话：[phone]电子信箱：[e-mail]所在院（系）：检验医学院专业、年级：2014级食品质量与安全指导老师：李建龙联系电话：[phone]申报日期：2016.4.29成都医学院教务处制项目批准号2填表说明1、本申报书仅作为大学生申报创新性实验项目专用。2、《成都医学院大学生创新性实验项目申报书》应逐项填写，内容实事求是，表达明确、严谨，空缺项要填“无”。要求一律用A4纸打印，于左侧装订成册。3、指导教师原则上应具中级及以上职称，主持过校级及以上课题，每位老师至多只能指导2个项目。4、项目执行时间1-2年。5、申请参加成都医学院大学生创新性实验项目的团队人数不得超过5人（1人为项目负责人，项目组成员不得多于4人）。6、《成都医学院大学生创新性实验项目申报书》由申报学生所在院（系）初审，签署意见后，正反面打印，一式一份，报送教务处。7.如填写申报书过程中有不明事宜，请与教务处联系和咨询（联系电话：62739117）。3申请者情况姓名何圆性别女出生年月199603所在院（系）检验医学院专业、年级食品质量与安全2014级学号1424460039课题来源无负责工作全面协调和组织项目的开展参与科研的情况及取得的成绩参与完成国家级大学生创新性实验项目的研究项目组成员情况姓名学号性别专业（全称）年级分工何圆1424460039女食品质量与安全2014级付梦茜1424460031女食品质量与安全2014级蒋蔓1424460059女食品质量与安全2014级李朝刚1424460005男食品质量与安全2014级陈春琳1524460040女食品质量与安全2015级指导老师情况姓名李建龙职称助教学历/学位硕士教学、科研经历先后参研国家自然科学青年基金、四川省科技厅重点科技自筹项目、四川省教育厅项目、共3项。主持四川农业大学优秀硕士学位论文培养基金（编号：YS2014010；3万元），2015.6月结题，申请国家发明专利3项（已授权），发表科研论文9篇，其中第一作者和并列第一作者5篇，另第一作者投稿SCI论文1篇（第1作者5篇，SCI论文1篇）。4研究方向食品微生物与发酵工程所在院（系）检验医学院E-mail地址[e-mail]指导教师意见何圆曾经参与国家级大学生创新性实验项目的研究，付梦茜、蒋蔓、李朝刚、陈春琳4位同学已通过检验医学院实验教学中心的入室考试，且经常和指导教师一起准备微生物试验课，已掌握微生物基本操作技能，能在老师的指导下保质保量地完成相关实验内容，他们熟悉本项目的相关实验技术，具有一定的研究经验和相关研究背景，有能力完成本项目。指导教师：（签名）年月日立项依据（包括国内外研究现状分析、拟解决的关键问题及研究意义，出主要参考文献）1立题依据1.1课题研究背景邻苯二甲酸酯(PhthalicAcidEsters，PAEs)又称酞酸酯，是世界上应用面极广的人工合成有机化合物之一。PAEs大多数为无色透明的油状液体，常温下不易挥发，具有耐热、耐光和耐低温等特点。由于在改变聚合物的性质、聚合物的加工及产品的性能方面能发挥巨大作用，PAEs被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋、乙烯地板、清洁剂、润滑油和个人护理用品等数百种产品中[1]，其在塑化剂中用量最大，约占总产量的80％[2]。PAEs作为增塑剂在塑料制品中与塑料的相溶性较好，但与塑料基质并不形成共价键,而是由氢键或范德华力相连,随着时间推移，可由塑料制品内迁移至外界环境，广泛地存在于土壤、水体、生物体和大气等环境中[3]。PAEs是一种环境激素，对其环境激素行为的测定国内外已有相关报道[4-6]，这类化合物已被称为第2个全球性“PCB”污染物[7]，近些年来已陆续被世界各国列为优先控制污染物，其作用类似于人工激素，毒性远高于三聚氰胺[8]，主要表现在：1）生殖发育毒性：PAEs生殖发育毒性的研究以动物实验研究为主，其中对雄性生殖发育毒性研究较多。对雄性动物生殖发育毒性表现为睾丸、前列腺、精囊的重量和组织形态学异常以及外生殖器畸形，精子数量下降、精子畸形率升高，雄性雌性化(肛门生殖器距离减小，乳头/乳晕保留)，青春期发育异常等。PAEs对女性作用的相关研究显示，PAEs与多种妇科病的产生有关，如子宫内膜异位5症、子宫肌瘤、怀孕周期缩短、早产、女童乳腺发育过早等。另外，PAEs可通过抑制胚胎细胞的增殖和分化导致大鼠胚胎畸形的发生[9]。2）肝毒性及三致作用：PAEs具有肝毒性，美国国家毒理规划署(NTP)的实验结果表明大鼠和小鼠能通过食物长期吸收DEHP而引起肝癌，同时DEHP的代谢单体MEHP也可引起睾丸间质细胞肿瘤。DEHP和DBP对动物模型有遗传毒性并可致畸，使动物行为表现异常。另外邻苯二甲酸二己酯(DEHP)可使胚胎致死和致畸，但是，啮齿类动物(大鼠、小鼠)过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)远高于人类，故DEHP可对大鼠、小鼠有致癌作用，而对人类是否具有致癌性还有待于进一步调查研究[10]。常见的邻苯二甲酯有：邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(DEHP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)和邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)等，其中卫生部规定邻苯二甲酸二丁酯(DBP)在食品及食品添加剂中的最大残留量最低（0.3mg/kg）[11]。近几年研究表明，DBP可引起动物的生殖发育毒性，DBP子宫暴露造成雄性个体后代睾丸萎缩、隐睾、尿道下裂、肛殖距缩短等症状[12]。邻苯二甲酸酯类化合物可通过自然光解、水解等来降低其在自然界中的含量，但是它们的半衰期都比较长，目前生物降解是处理邻苯二甲酸酯类化合物的主要途径之一[13-15]，对邻苯二甲酸酯类污染物的生物降解处理仍有待于筛选高效的降解菌，以提高降解率。曾锋[16]等通过驯化富集培养，从处理石化厂废水的活性污泥中分离出1株邻苯二甲酸酯降解菌FS1，研究了菌株FS1对邻苯二甲酸二丁酯的生物降解特性，最终确定菌株FS1降解最适酸度为pH6.5～8.0，温度为20～35℃，同时菌种量、振荡速率对DBP的降解有一定的影响。周洪波[17]等从湘江底泥筛选分离出能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的菌株Sphinggomonsasp．，经摇床培养后实验表明最佳降解条件为温度35℃，初始pH为7.0，转速150r/min，在最佳的降解条件下，40h之内DBP可完全降解。段星春[18]等采用水一硅油双相体系从污染土壤中驯化分离到2株能够以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为惟一碳源和能源生长的菌株TS2H、TS2L，经过形态特征、生理生化以及16SrDNA序列分析，菌株分别鉴定为乙酸钙不动杆菌属(Acinetobactercalcoaceticus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，结果表明，菌株TS2H、TS2L在内对40mg/L初始浓度DBP的降解率分别达到98.64％、74.62％。目前，国内外已经就PAEs生物降解做了大量的工作，主要包括高效降解菌株的筛选和降解动力学研究、以及酶促降解性和降解途径等方面。但是，利用降解菌进行降解可能存在一些弊端，例如有些菌株的适宜生长时期与其降解时期不一致；一些菌株安全性不高，对人类和环境造成不利等。近些年来一些学者通过利用降解菌的邻苯二甲酸酯降解酶来测定其对邻苯二甲酸酯类的降解特性[19]，从而6可解决利用降解菌所带来的弊端。1.2课题研究现状对于邻苯二甲酸酯类酶促降解特性的研究，国内外已有大量研究工作开展。研究人员Pierce[20]等通过在实验室接种细菌可观察到DOP降解为MOP和苯二甲酸，随后在加氧酶的作用下使得芳香环断开，成为相应的有机酸，进而转化为丙酮酸等物质，最终降解为CO2和H2O。曾锋[21]等通过研究PseudomonasfluorescensFS1的邻苯二甲酸酯降解酶对邻苯二甲酸二丁酯的降解特性，结果表明PseudomonasfluorescensFS1的邻苯二甲酸酯降解酶属胞内酶，PseudomonasfluorescensFS1的邻苯二甲酸酯降解酶对邻苯二甲酸二丁酯的的最适酸度为pH6.5～8.0，最适温度为25～35℃，米氏常数Km为215.05nmol/mL。在好氧条件下，邻苯二甲酸二丁酯与PseudomonasfluorescensFS1的邻苯二甲酸酯降解酶作用，形成邻苯二甲酸单酯和邻苯二甲酸后，可进一步降解成苯甲酸、对羟基苯甲酸和酚，最终转化为CO2和H2O。陈济安[22]等从污水处理厂的活性污泥和塑料厂排污口土壤中分离到两株邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)降解菌CQ0110Y和CQ0110G，通过研究二者粗酶液的相关性状及其对DEHP的酶促降解特性，结果表明菌株CQ0110Y和CQ0110G降解酶都属于胞内酶；二者都是在10℃比较稳定，但是最适pH略显不同，CQ0110Y粗酶液在pH6.0~8.0之间较为稳定，而CQ0110G粗酶液在pH6.0~7.5之间比较稳定。近几年塑化剂引起的食品安全问题已引起了人们的广泛关注，严重威胁着人类的身体健康，而塑化剂中使用最普遍的即是邻苯二甲酸酯类的化合物，台湾地区的“起云剂”事件，大陆地区的“酒鬼酒”等高档白酒发现塑化剂，塑化剂已经引起恐慌，塑化剂事件极大的影响了我国白酒行业的健康发展，同时也显示出我国标准体系的不完善性。虽然已有筛选邻苯二甲酸酯类降解菌工作的开展，但所报道的细菌对于PAEs的生物降解还不能满足实际污染控制的要求，因此仍需筛选更加安全、高效的降解菌。枯草芽孢杆菌具有耐氧化、耐高温、耐酸碱等特性[23-25]，枯草芽孢杆菌为公认的益生菌，酶是由蛋白质组成，其安全性远远大于微生物菌株，对其降解酶进行研究，为邻苯二甲酸二丁酯降解酶应用于环境或食品中提供理论数据。拟解决的关键问题1.对邻苯二甲酸二丁酯降解酶进行定位，便于大量提取降解酶，为后续试验提供材料。2.研究降解酶的酶学性质，为降解酶应用环境、食品提供理论数据。前期研究基础：项目研究者在攻读硕士学位论文期间，一致致力有毒物质的生物降解研究，前期已筛选到多株对拟除虫菊酯、有机磷农药和塑化剂的降解菌株，并研究菌株作用于底物的降解特性、降解产物和降解7酶及降解途径的的分析，在研究微生物降解有毒物质方面具有丰富的研究经验，研究成果已发表9篇文章（第一作者5篇），3个发明专利（已授权），其中1篇SCI处于专家复审阶段。[1]李信柱,杜娟.方兴未艾的临苯二甲酸酯限用法规[J].电子质量,2010,2:38-39.[2]雷艳虹.常见塑化剂简介[J].化学教学,2013,4:71-73.[3]刘敏,林玉君,曾锋,等.城区湖泊表层沉积物中邻苯二甲酸酯的组成与分布特征[J].环境科学学报,2007,27(8):1377-1383.[4]JaraS,etal.Determinationofphthalatesinwatersamplesusingpolystyrenesolid-phaseextractionandliquidchromatogra-phyquantification[J].AnalChemActa,2000,407:165-171.[5]戴天有,周文敏.水和废水中酞酸酯的测定[J].中国环境科学,1994,14(2):85-89.[6]Xiang-ZhouMeng,etal.Flowofsewagesludge-bornephthalateesters(PAEs)fromhumanreleasetohumanintake:Implicationforriskassessmentofsludgeappliedtosoil[J].ScienceofTheTotalEnvironment,2014,476-477:242-249.[7]USEnvironmentalProtectionAg