2011AC_Anoptimizedmagnetitemicroparticle-basedphos

在免疫沉淀蛋白中以确定多个磷酸化位点的一种基于磷酸肽富集优化的磁铁矿微粒策略摘要为了进一步提高选择性和实时细胞裂解液样品磷酸化肽分析产出，在这里我们证明了一个通过新合成的磁铁矿微粒高效富集磷酸肽的方法和质谱分析方法。磁铁矿微粒显示了良好的磁响应性和在溶液中磷酸肽富集再分散性。首先通过对包含已知的磷酸化和非磷酸化蛋白的混合物磁铁矿微粒富集磷酸肽的选择性和灵敏度进行评估。与商用的二氧化钛薄被磁性珠相比，我们的磁铁矿微粒对磷酸肽的富集具有更好的特异性。来自β-酪蛋白胰蛋白酶消化的选择性富集磷酸肽可以检测到0.4fmol/μl，而单磷酸肽的回收率约为90%。基于亲和技术并优化富集条件的磁铁矿微粒被立即应用于识别信号蛋白所有的磷酸化位点，蛋白是从刺激哺乳动物细胞培养液中分离的。从磁铁矿颗粒富集步骤洗脱下来的大部分肽碎片通过串联质谱法作为单或多磷酸化种类被识别和表征。由于富集磷酸肽的实用高效，在磷酸化蛋白质组学研究实时细胞裂解液时磁铁微粒保持着巨大的潜力。可逆磷酸化是最重要的一个遗传翻译修饰法（PTMs），它规定了细胞的处理工艺。据估计，在哺乳动物细胞中超过30%的蛋白质被暂时或永久磷酸化。在分子水平上对这些生物工序理解其机理要求具有磷酸化蛋白的特征。通过自上而下与自下而上的蛋白质组学方法质谱（MS）已被用作为识别和表征磷酸化蛋白质的精确工具。研究报告范围从大规模的高流通量的磷酸化蛋白识别精确定量磷酸化蛋白质组的特殊磷酸化的情况和磷酸化位点的定位。然而，由于受到有限样本量，低拷贝数，信号抑制，电离效率的影响，通过质谱分析磷蛋白仍然存在挑战，在MS分析化之前或分析时磷酸化碎片易损耗。例如，质谱中的磷酸肽正离子信号通过从其他非磷酸肽母体被抑制，该现象归因于低丰度和酸性天然的磷酸肽。通过富集磷酸肽提高质谱分析的离子信号的步骤通常是对来自复杂的蛋白水解混合物磷酸化肽识别的必要准备步骤。各种丰富的策略已经被开发，包括免疫沉降法（IP），化学改性，和固定金属亲和层析色谱法（IMAC），而这些方法，IMAC是在线和离线液相色谱应用最广泛。在IMAC柱，金属离子（Fe3+，Ga3+，Zr4+等）通过能与磷酸化肽金属结合配体固定在琼脂糖树脂上。其他的各种亲和媒介已经开发，包括二氧化钛柱，氧化锆柱，铝氢氧化钠柱，与磷酸锆硅片。在IMAC柱由于非磷酸化肽的非特异性吸附磷酸化肽的选择性吸附而受限制，特别是含有多个肽酸性残基。此外，IMAC柱的制备是耗时的，且需要多步的，包括树脂负载，金属离子螯合，重复洗涤。作为上述方法的另一种方法，功能化的纳米颗粒（NPs）可以作为一个水溶性探针快速具体地浓缩目标生物分子。不同于以往的柱状或平面支撑板，由于纳米颗粒的巨大的表面面积与体积比这些“'悬浮分散法”提高分散的均匀性和效率和简易表面工艺。各种分子可以共价结合在NP-表面，以如磷酸肽目标生化分子反应形成稳定的共轭物。为了达到卓越的分离能力，纳米颗粒表面工程可以进一步调整为一个具有磁芯（例如，磁铁矿，磁赤铁矿）的核心/壳结构加速亲和探针的收集。最近几次报道磁性表面纳米粒子探针为直接质谱检测有效的提取和富集磷酸化肽段，包括Fe3O4@TiO2（ZrO2，Al2O3）NPs，Fe3+固定介孔纳米二氧化硅，Fe3+固定化分子筛纳米晶体，Ce4+固定化磁性二氧化硅微球，磁性探头显示了一个很大的优势，对微量的目标磷酸肽成富集和在生物混合物溶液中快速分离。相比之下，非磁性探头分离需要长时间高速离心，往往导致其它肽的非特异性包裹，特别是大分子量的非磷酸化肽。除了固定金属离子之外，金属氧化物（TiO2，ZrO2，Al2O3等）已发展到从复杂样品中选择性地浓缩磷酸化肽。这些金属氧化物显示出更好的选择性，因为拥有磷酸基团的被分析物通过单，双和双齿桥联协调模式可以自动组装到金属氧化物表面。然而，在以往的研究中，磁性氧化铁材料（磁铁矿和磁赤铁矿）作为磁核亲和探针。磷酸肽富集没有被重点使用磁性氧化铁材料[简要]。磷酸化肽段的富集没有把使用磁性氧化铁材料作为核心。赤裸的磁性氧化铁纳米颗粒富集磷酸肽以前已被证明。在这里，我们评估了使用亚微米级大小的磁铁矿微粒的可行性，作为对磷酸肽富集亲和探针在溶液中磁铁矿微粒具有高磁的响应性和再分散性。亚微米级的磁铁矿微粒采用一步水热法合成，与微粒相结合的超顺磁性活性和磷酸化肽富集，因此避免耗时的核心/壳结构工艺，其次是表面功能化。相对于TiO2/Fe3O4的核/壳纳米粒子（商业二氧化钛磁珠），新开发的磁性微粒对磷酸肽表现出更好的专一性/选择性。此外，我们证明了实用程序通过信号蛋白微粒富集磷酸肽，通过IP从脂多糖（LPS）刺激细胞分离富含亮氨酸重复Fli-1，反应蛋白2（LRRFIP2）。LRRFIP2是第一个发现在传导中发挥重要作用的wnt信号。利用双标记定量蛋白质组学的方法，确定LRRFIP2作为关键受体蛋白一个相互作用的合作伙伴，对中间受体（TLR）的信号，髓系分化原发性反应基因88（MyD88）。在我们最近的工作中的功能特性新的MyD88相互作用的蛋白，发现LRRFIP2是信号激活器。由于它含有丰富的丝氨酸，我们推断那些识别的磷酸化的位点在LRRFIP2可以积极参与调节蛋白质–蛋白相互反应的TLR/MyD88介导的信号转换。考虑低丰度和动态性质的磷酸化的信号，为磷酸化的高效、高产的选择最适的富集方法是极其重要的。在接近内源性水平找出有关生理LRRFIP2磷酸化位点，附加表位的LRRFIP2蛋白通过IP人胚胎肾（HEK）细胞从细胞裂解液中分离。富集后，共有19个磷酸化肽段被鉴定。材料与方法材料所有化学物质和蛋白质，包括氯化铁（Ⅲ），乙二醇，醋酸钠，磷酸，甲酸，碳酸氢铵，氨，牛血清白蛋白（BSA），从马的心脏提取的肌红蛋白，细胞色素C（Cyt-C），鸡清蛋卵白蛋白，牛α-酪蛋白，牛β-酪蛋白，标准磷酸肽，α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），和2，5-二羟基苯甲酸（DHB），所有试剂来自Sigma（St路易斯，MO，USA），使用时没有进一步纯化。测序修饰级胰蛋白酶购自Promega（麦迪逊，WI，美国）。乙腈（ACN）购自默克（达姆施塔特，德国）。所有的水溶液使用的水由Milli-Q系统制备（Millipore，贝德福德，MA，USA）。合成的磁铁矿（Fe3O4）微粒亚微米级，超顺磁性微粒的合成如前面所述。简单的说，FeCl3.6H2O（1.35g，5mmol，97%）溶解于乙二醇（40ml，98%），搅拌至澄清的溶液，然后加入醋酸钠（3.6g，99%）。混合物剧烈搅拌60分钟，然后密封在不锈钢反应釜（50毫升容量）。反应釜加热到200度并在被允许冷却到室温前保持8小时。黑色产品用乙醇和除气的Milli-Q水洗几次然后在60度干燥6小时。磁铁矿（Fe3O4）微粒的表征粉末X-射线衍射（XRD）样品被收集在ScintagPADx衍射计和铜Kα辐射（45kV，35mA）。透射电镜（TEM）图像通过在200kV操作JEOL2010电子显微镜获得。扫描电子显微镜（SEM）研究是在FEIXL40大发FEG显微镜上完成的。在TJAIRIS电感耦合等离子体光谱仪进行元素分析。蛋白质消化和富集磷酸肽在比率为1:40的酶/底物下磷酸化蛋白β-酪蛋白（2μg/μl）在37度过夜被胰蛋白酶消化。β-酪蛋白消化使用含10%乙腈和1%乙酸缓冲溶液（pH2.8）稀释至40fmol/μl以对磷酸肽富集作用的评价。1.5μl磁铁矿微粒（100μg/μl，总共150μg）加入预混合肽混合物样品200μl（总共8pmol），涡流混合10分钟。室温肽吸附孵育10分钟后，磁铁矿微粒由磁铁收集，依次用孵育缓冲液和含有10%乙腈和0.1%乙酸洗涤缓冲液洗涤。加入缓冲液洗涤微粒后，为了确保在溶液中磁铁矿微粒完全分散这里需要一个孵育30秒的时间步骤。未吸附的非磷酸化肽在一系列洗涤中除去。洗脱缓冲液（10μl，200mMpH11为氢氧化铵溶液）洗涤结合磷酸肽。洗脱液（0.5μl）是直接应用渡有相同金属的基质辅助激光解吸器/电离样品板特征质谱(MALDI–TOFMS)仪。相比之下，没有富集的纯胰蛋白酶β-酪蛋白消化液通过MS也进行了分析（0.5μl原始浓度样品，总共20fmol，通过分析被发现）。选择性和磁铁矿（Fe3O4）优化微粒磷酸肽富集蛋白质混合物1，一个更复杂的标准样品，包括15fmol/μlBSA，60fmol/μl肌红蛋白，80fmol/μl细胞色素C，20fmol/μl鸡清蛋卵白蛋白，和20fmol/μlβ-酪蛋白在200μl溶液，用于研究磁铁矿（Fe3O4）微粒的选择性。蛋白质混合物2，含15fmol/μlBSA和8fmol/μlβ-酪蛋白在200μl溶液，是用于优化孵育缓冲液。不同的缓冲区乙酸浓度（0.1%乙酸在10%乙腈和1%乙酸在10%乙腈乙酸）进行比较。在相同条件下两种蛋白质混合物被消化为β-酪蛋白。这个浓缩试验是按照上面提到的相同程序进行的。与商用二氧化钛包覆磁性珠比较富集磷酸肽能力商业二氧化钛包覆磁性珠和磷阱富集试剂盒（珀金埃尔默）用磁铁矿微粒富集方法进行比较。200μl蛋白质消化混合物的水溶液3，含有4pmol/μlBSA和0.4pmol/μlα-酪蛋白（混合α-酪蛋白S1和β-酪蛋白S2，总浓度0.4pmol/μl）在为浓缩程序中使用。使用商业二氧化钛磁珠的富集是根据厂家提供方案执行的，而磁铁矿微粒富集根据上面提到的相同过程进行的。回收率的测定在m/z2061.8Da（Sigma）序列为FQpSEEQQQTEDELQDK磷酸肽（4pmol）溶解在200μl孵化缓冲液。浓缩试验根据上面提到的相同步骤进行。10%ACN0.1%乙酸和10%乙腈，1%乙酸体系都用作孵化缓冲液。在磁铁矿微粒富集后，用200mM的氨水溶液洗涤将磷酸肽洗涤2次，每一步，持续10分钟。洗脱液分别标记为步骤1和步骤2。然后，20pmol肌红蛋白胰蛋白酶消化液（10μl）添加到10μl洗脱液作为内部标准（总体积20μl）。在对照实验中，4pmol磷酸肽溶解在10μl200mM氨直接与10μl肌红蛋白的胰蛋白酶消化液混合（总共20pmol）。0.5μl洗脱剂和控制用MALDI-TOFMS表征发现在板上。细胞培养，分离，和使用LRFFIP2对磷酸化位点识别HEK293T细胞系中稳定表达TLR4的培养如前面描述。根据制造商的说明书用脂质体2000（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，美国）可将LRFFIP2转染293T–TLR4细胞。整个细胞裂解液含有约600到1000万的细胞用小鼠免疫球蛋白G（IgG）和G蛋白琼脂糖。Flag标记的蛋白进行免疫沉淀从小鼠单克隆抗FlagM2抗体琼脂糖上（sigma，Chemical）。使用沉淀十二烷基硫酸钠（SDS）的凝胶加样缓冲液免疫洗涤，并通过Nu-PAGE4–12%Bis-Trisgel（Invitrogen）分离。在胶内酶解倍应用于蛋白质带的兴趣，使用质谱和浓缩方法兼容包含乙腈和水的缓冲液提取肽。肽提取后，醋酸浓度调整为1%。十分之一的肽为蛋白鉴定被保存。用上面提到的相同的工艺富集磷酸化肽。原始肽和富集肽，10μl洗脱液被收集并使用MALDI–TOFMS鉴定（浓缩肽，1μl被用于每一个点，总共10μl）。MS鉴定MALDI–TOF和串联MALDI（TOF/TOF）质谱通过AppliedBiosystems4700组分析仪在355nm使用一个200赫兹的Nd：YAG激光技术获得的（Framingham，MA，USA）。数据采集之前通过使用标准蛋白质肌红蛋白消化液进行外部校准。在串联质谱（MS/MS）分析，通过1kV碰撞电压空气被用作碰撞诱导解离（CID）的碰撞气体。光谱的获得是通过2000个到3000个激光连续射击的积累。混合的DHB（30μg/μl，0.5μl）和磷酸（1%，0.5μl）作为本研究的MALDI基质（DHB基质）。液相色谱-质谱法在LTQOrbitrapXL仪器（ThermoScientific，SanJose，CA，USA）耦合到纳超二维系统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