20120830-海洋生物制品学-第七章

第七章基因工程菌苗第一节概述自从抗菌药物发明和应用以来，临床常见的细菌性感染和细菌性感染和病死率已经大幅度下降。但是随着抗生素应用的增多，更强的抗性菌株相继出现。细菌一旦获得耐药性，会将抗性基因传播到其他敏感菌，使之成为耐药菌株，给临床传染病的治疗带来困难。据WHO1996年报道，全球每年死亡约5000万人，其中约1/3死于传染病，而自19世纪以来由于菌苗的成功应用，传染病的发生已明显减少。在发达国家，破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率明显降低。新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继开始。在过去20年中，有29种新传染病出现，其中包括10种细菌性传染病（列于表7-1，摘自马大龙主编的《生物技术药物》）。重要病原体全基因测序的开展和完成以及类似生物表型的不同均属间的同属序列和异源序列的发现，有利的促进了新的疫苗研制。控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意和共识。因此，有必要加快创新性的细菌菌苗的研制与开发。P190表7-1新鉴定的病原体第二节目前应用的菌苗及其存在问题一、目前应用菌苗的类别由细菌、支原体、螺旋体等制成的疫苗称为细菌性疫苗。细菌性疫苗按其所含成分的不同可分为3类，即活菌疫苗（弱毒苗）、死菌疫苗（灭活苗）、纯化的多糖或蛋白成分苗。1.活菌疫苗2.死菌疫苗3.亚单位苗或成分苗①从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的类毒素苗，如破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（DT），免疫后诱导机体产生的抗血清能特异中和和TT破伤风类毒素或DT白喉类毒素、其保护效果可以达95%以上。由于毒素纯化方法的改进，产品的副作用很小。②荚膜细菌纯化的多糖菌苗，可诱导产生的抗体以保护集体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流感杆菌b（Hib）、伤寒杆菌Vi多糖等多糖苗，能诱导机体产生T细胞非依赖性的抗体反应，其特点是诱导时产生短期的IgM抗体，缺乏免疫记忆，对不到18个月幼儿的多糖苗免疫性差，而没有保护效果。因此多糖类的菌苗亟需改进。P191～192表7-2目前可用于人群的菌苗二、目前菌苗存在的问题及研制的新方法1.目前菌苗存在的问题①尽管疫苗取得了巨大的成功，但小于5岁的婴幼儿每年死于传染病的数目仍然很高。如疟疾、几种腹泻病等均无有效疫苗，虽然卡介苗（BCG）使用几十年了，甚至纳入WHO的计划免疫，但其效果波动很大（0～80%），因此亟需安全有效的结核菌苗问世。②与病毒相比，基因工程菌及细菌核酸苗报道明显为少。至今国际上还没有成功满意的重组细菌苗提供人群使用。关于细菌毒素的分子及其编码基因育调控的机制都比较清楚，因此，有关毒素的基因工程菌苗的构建或早提构建等均无问题，但细菌外膜上的其他结构如黏附分子、侵袭蛋白、鞭毛及脂多糖等分子结构十分复杂，编码基因多呈丛分布，如LPS的表达涉及近30个基因的级联反应，操作起来尚有困难，因此还有毒力相关或保护相关基因的分离、克隆和表达等基因工程研制的前期工作要做。2.研制菌苗的新方法三、理想菌的条件疫苗的目的是激起免疫反应，但不使人遭受实际感染的危险。一个理想的疫苗将引起与天然感染相同程度或更好的免疫。理想疫苗复合如下条件。①安全，不能有毒性。大量人群应用疫苗，即使有低水平的毒性也不能接受。②遗传形状稳定，无致癌性，无致畸变或致流产性。③结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。④接受疫苗接种的歌年龄组人群必须能够很高比例地产生保护性免疫。成功的疫苗一般能产生长效的免疫记忆。⑤多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。因为一字儿感染性病原体在进入机体后不久便感染宿主细胞，因此这类感染性病原体预存特异性抗体阻止病原微生物进入细胞时特别必要的。对感染病原体的免疫应答通常涉及指向多个表位的抗体，只有其中一些抗体提供保护。因此，有效的疫苗一定导致准确指向感染微生物表位的抗体和T细胞的产生。⑥能口服，能有效诱导粘膜免疫。⑦为大量人群应用，疫苗必须廉价。⑧易于生产，贮存及服务不需冷藏。第三节重要细菌基因工程苗的研究进展当国内外细菌基因工程菌苗对细菌感染性疾病的问题有：①现有菌苗保护效果不好；②副反应大；③难以培养的细菌；④可诱导癌症，有严重后遗症；⑤新出现的病原体或新变异病原菌。一、霍乱菌苗霍乱（cholera）是发展中国家常见的急性腹泻病之一，其发病急、传播快、波及面广且危害严重，是我国法定管理的甲类传染病。霍乱是革兰阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CT）引起腹泻及其他症状。霍乱弧菌可根据菌体抗原分为200个以上的血清型。1889～1923年的第6次大流行均由O1群古典型霍乱弧菌引起。第7次大流行自1961年延续至今，波及五大洲。1992年出现了一新的流行株O139血清型霍乱，目前流行的霍乱为O1和O139两种血清型。目前使用的霍乱弧菌为灭活全菌体或全菌与其毒素的结合物，对成人有效，但不能诱发儿童免疫反应。P194表7-3CT/CT-B佐剂应用的抗原二、痢疾菌苗细菌痢疾是我国及许多发展中国家的常见病及多发病，其发病率多发病，其发病率始终居24种法定传染病的前2位。主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠粘膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆，临床表现为发热、脓血便、腹泻、里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合征。痢疾杆菌共4群：志贺痢疾菌（Shigelladysenteriae）、福氏痢疾菌（S.flexneri）、鲍氏痢疾菌（S.bordii）和宋内痢疾菌（S.sonnei）。按其菌膜表面LPS-O抗原分为44个血清型。在我国及其他发展中国家主要流行型分别是福氏痢疾和宋内痢疾。菌体表面LPS和侵袭蛋白（Ipas）编码记忆主要定位于大质粒。目前已知枝梢7个基因和15个蛋白质与痢疾杆菌入侵宿主细胞相关，它们作为Ⅲ型分泌系统的调节子和效应子，以解除依赖方式被分泌进入宿主细胞。目前，痢疾疫苗的开发方向主要有两个：一个是减毒活疫苗，一个是化学组疫苗，其中减毒活疫苗是木匪浅开发痢疾疫苗候选株的主流。Meitert等（1984）在胆盐平皿连续传代32代获得福氏2a减毒株IstratiT32;20世纪80年代初中国近10000人现场观察，证实T32菌苗安全，有保护性，效果与免疫次数和剂量有关。三、产毒性大肠杆菌肠毒素大肠杆菌（entertoxigenicEscherichia，ETEC）是造成发展中国家婴儿和旅游者细菌性腹泻的主要致病菌之一。全球年病例为2.1亿次，死亡病例达38万，多为5岁以下的儿童。其表面定居因子抗原（colonizationfactorantigens，CFA）和耐热肠毒素（ST）与不耐热肠毒素（LT）共同作用导致腹泻，是ETEC疫苗的重要成分。在已发现的CFA中，CFA/I、CS6和CS3在流行的ETEC中分布最广泛的3种优势菌毛抗原。正在采用减毒痢疾菌为载体进行LT或菌毛抗原的表达，进行多价菌苗研制的前期工作，或用重组的BCG为载体进行LT-B的表达研究。国内早年构建表达K88、K99及LT的幼畜工程菌苗已投入生产。四、肠出血性大肠杆菌苗大肠杆菌O157：H7是出血性大肠杆菌的主要病原菌。飞996年日本大规模爆发O157出血性肠炎以来，引起国际上的极大关注。致病特点通过特殊的黏附分子（intimin）黏附靶器官，产生类志贺毒素和肠溶血素等，症状表现为出血性腹泻、溶血性尿毒综合症、血栓形成性血小板减少性紫癜。五、伤寒杆菌苗伤寒是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统、肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门菌（Salmonellatyphi）。临床表现为长期发高热，胃肠炎，败血症等。世界伤寒杆菌感染病例约为300万，死亡人数50万，在过去15年间，两种新型伤寒疫苗获准在全球广泛使用，一种是注射疫苗，另一种是口服疫苗，在许多国家，这些疫苗基本上取代了旧的强反应原性、加热-石炭酸灭活群菌体疫苗。1.伤寒Vi多糖疫苗2.Ty21a疫苗六、结合菌苗结核病（tuberculosis,TB）是一种流传广、危害大的传染病。居世界卫生组织（WHO）估计，目前全世界约有20亿人隐性感染结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB），每年有800万新发患者和300万患者死亡。近年来，随着人口流动的增加，多重耐药菌株的流行，以及MTB和人类免疫缺陷病毒（HIV）的双重感染，导致TB的发病率和死亡率大幅度上升。卡介苗（BCG）作为目前唯一广泛应用的预防结核病的疫苗，具有安全、廉价的特点。近年来对BCG保护力的效果意见不一，据报道其保护效果从0～80%不等，以及在艾滋病人和HIV携带者接种BCG后发生全身性感染，促使人们烟具新一代结核菌苗。1.蛋白质亚单位疫苗2.核酸疫苗3.重组卡介苗七、b型流感嗜血杆菌结核疫苗流感嗜血杆菌（Haemophilus,Hi）为革兰阴性的有荚膜短小杆菌，可引起人类多种传染性疾病，最常见和最严重的是脑膜炎，其次是肺炎。根据Hi主要的毒立因子——荚膜的有无，可将其分为两大类，有荚膜型和无荚膜型。前者有a、b、c、d、e、f6个荚膜类型别，其中b型最为流行，毒力最强，主要感染对象为儿童，几乎所有由Hi所引起的脑膜炎病例和大多数其他菌血症病例是感染b型2菌所致。八、细菌的DNA苗DNA菌苗是用编码康源基因的真核表达质粒DNA直接接种后，被细胞摄取并转录翻译，表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异性免疫应答。细菌DNA免疫研究情况列于表7-4（引自马大龙，生物技术药物）。P197细菌DNA免疫研究情况在核酸免疫研究中，用减毒的胞内细菌释放DNA苗的报道引人注意。绝大多数的胞内菌都可被DNA转染，携带这些质粒进入细胞的吞噬泡或胞浆，可释放DNA、表达编码抗原、诱导体液或细胞免疫。与裸DNA释放相比，用细菌释放DNA的优点如下。1.增加靶向性2.增加免疫原性3.增加免疫途径第四节基因工程菌苗的开发战略①创新疫苗的研制、开发和应用。近年对疫苗的主要贡献之一就是将荚膜多糖与蛋白载体交联起来，研制多糖-蛋白结合苗，使载体蛋白特异的T细胞参与辅助B细胞，产生多糖特异的抗体，解决了长期以来多糖疫苗对2岁以下的婴幼儿无效和无记忆反应的问题。Hib嗜血流感杆菌-蛋白结合苗成为WHO的推荐项目，并建议推广至其他荚膜多糖疫苗中去。②对病原体致病与发病机制的认识及宿主抗感染免疫机制的了解。③粘膜疫苗及黏膜释放途径是创新疫苗研制的重要方向。④人类重要病原体基因组测序的完成，将为创新疫苗的研制提供新的机会和条件。⑤创新疫苗的研制需要不同学科的协作、理论的融合及各类生物技术包括动物模型的合理使用与创建。