2012CB910200-G-天然免疫应答相关蛋白的鉴定结构与功能

项目名称：天然免疫应答相关蛋白的鉴定、结构与功能首席科学家：舒红兵武汉大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部湖北省科技厅一、关键科学问题及研究内容（一）关键科学问题病原微生物感染后，通过模式识别受体（PRRs）激活一系列的信号转导通路，诱导炎症因子和I型干扰素的表达。这些细胞因子进一步诱导下游效应蛋白的表达，启动天然免疫反应及后期的适应性免疫。目前，对这些过程所涉及的蛋白质及其结构与功能机制尚知之甚少。本项目拟解决的关键科学问题包括：1.是否还存在新的检测病原微生物病原相关分子模式（PAMPs）的PRRs？这些新型PRRs的结构特点和功能机制是什么？2.病原微生物感染诱导I型干扰素和炎症因子的信号转导机制是什么？I型干扰素和炎症因子的表达如何受到精细调节从而避免过度的天然免疫引起的免疫损伤或自身免疫性疾病？3.天然免疫效应主要由哪些蛋白介导？这些效应蛋白发挥作用的机制是什么？它们本身的活性如何被调节？4.上述天然免疫相关蛋白的结构与功能有何关系？（二）主要研究内容围绕上述关键科学问题，本项目拟从以下几方面开展研究：1.I型干扰素诱导表达的信号转导及其调节相关蛋白的鉴定和功能机制病原微生物感染宿主细胞后，诱导细胞表达I型干扰素。I型干扰素是天然免疫应答的重要介导因子。但是，I型干扰素诱导表达的细胞信号转导过程及其分子调控机制有待深入研究。本项目将以RNA和DNA病毒的感染为研究模型，综合运用多种筛选方法，寻找病原微生物诱导的I型干扰素表达这一过程的关键信号分子及调节蛋白，从分子、细胞、动物模型等层次阐述它们的生物学功能与调节机制，揭示宿主在病毒感染早期普遍的天然免疫应答规律。2.新型天然免疫受体及其介导的炎症反应相关蛋白的鉴定和功能机制天然免疫受体介导的炎症反应是天然免疫应答研究的重要内容。适度的炎症反应是针对病原微生物的防御反应，而过度的炎症反应则引起免疫损伤和自身免疫性疾病。本项目将鉴定与炎症反应相关的新型PRRs及其信号转导分子；在细胞和个体水平上，通过各种感染模型分析上述新型PRRs和信号转导分子对炎症反应的调控作用；通过观察天然免疫相关蛋白的翻译后修饰的类型和位点，探索天然免疫相关蛋白相互作用的分子基础；发现天然免疫受体相互协调或拮抗的效应与分子机制，探讨多种信号通路的交叉调控效应，完善天然免疫精确调控网络。3.天然免疫效应蛋白及其调节网络研究I型干扰素诱导的天然免疫效应蛋白可以通过多种途径阻断病毒的复制过程，同时某些效应蛋白还能反馈调控干扰素诱导表达的信号转导通路。虽然目前对于一些效应蛋白及其相应的作用机理已有一定程度的了解，但是要想更全面更深层次地挖掘其中的奥秘，鉴定新的效应蛋白是十分迫切和必要的。任何新的抗病毒机理的发现都将有利于深入了解病毒复制过程、致病机理等重大基础理论问题，同时为防治病毒所引起的疾病提供理论依据和新策略。我们将以果蝇为模式生物，利用生物信息学、基因芯片等方法系统全面地筛选、鉴定和验证新的天然免疫效应蛋白；深入探讨天然免疫效应蛋白的抗感染作用机制，以及反馈调控I型干扰素诱导表达的信号转导通路的分子机理，构建一个天然免疫效应调节的分子网络。许多病原微生物进化出能有效抑制I型干扰素表达从而抑制早期天然免疫及后期适应性免疫的能力。但目前这方面的研究由于缺乏适用的动物模型，尚停留在体外实验阶段。我们将利用多种人类病毒感染动物模型，采用病毒外膜蛋白抗原抗体-IFN融合蛋白将I型干扰素特异性靶向定位到病毒感染的细胞上，进而探讨并阐明I型干扰素和病毒蛋白之间的互作关系。4.天然免疫应答相关蛋白发挥功能的结构基础虽然人们对天然免疫信号通路，特别是其中涉及的主要蛋白和其上下游关系，已开展了广泛研究，但是由于缺乏相关结构信息，人们一直无法从原子水平上了解信号传导的分子机制。因此，从结构生物学的角度，解析天然免疫应答相关重要蛋白质及其复合物的高分辨率三维结构，结合系统性的功能研究，详细并深入地阐释病原微生物感染与复制、天然免疫受体特异性识别病原微生物以及信号转导与交互调控的结构机制，具有十分重要的科学意义。本项目将以天然免疫应答相关蛋白质及其复合物为研究对象，围绕病原微生物识别、感染与逃逸，以及宿主免疫信号转导与调控等国际前沿领域，从结构生物学的角度，研究RLRs等天然免疫受体特异性识别病原微生物并激活信号转导的结构机制；发现TRAF等接头蛋白在天然免疫信号转导过程中的作用机制；解析蛋白-蛋白相互作用关键位点及磷酸化相关构象特征对天然免疫信号转导的影响与机理；探索干扰素诱导蛋白的功能与结构新机制；揭示病原微生物逃逸宿主天然免疫反应的攻击，实现免疫耐受的结构基础和致病机理。二、预期目标总体目标：本项目的总体科学目标是系统地从细胞抗病毒、细胞抗细菌等病原微生物的天然免疫识别机制、信号转导调控、炎症因子及干扰素效应蛋白的作用等多个角度鉴定一批新的天然免疫应答相关蛋白，结合蛋白质三维晶体结构测定，阐明其结构与功能基础，并深入探讨相关的作用机制。通过本项目，我们希望在天然免疫这一国际竞争异常激烈的研究领域取得具有重大原创性成果，揭示机体抗病原微生物感染的天然免疫反应的分子机理，鉴定出可用于抗感染药物筛选的分子靶标；为国家在严重传染病防治、生物防卫等方面提供理论和技术储备及咨询服务；提高我国在感染与免疫这一重要科学领域的国际地位，争取使我国成为国际上这一领域的学术研究中心之一，实现我国在这一学术领域的跨越式发展。五年预期目标：*在下列领域做出原创性成果：-I型干扰素诱导表达的信号转导及调控机制；-天然免疫受体介导的炎症相关反应机制；-天然免疫效应蛋白及其调节机制；-天然免疫相关蛋白的结构与功能关系。*克隆或鉴定出10个以上新型PRRs和信号分子（或确定已知分子在天然免疫应答上的新功能）；解析6-8个天然免疫相关重要蛋白质及其复合物的三维结构，揭示天然免疫信号转导与调控网络中蛋白-蛋白相互作用及蛋白质修饰的关键构象特征，阐释天然免疫应答相关蛋白结构与功能的关系。*利用我们构建的体外和体内模型，全方位系统地分析、验证参与天然免疫的各效应分子和通路之间的相互联系和协同作用。*鉴定多个可供相关疾病诊断、治疗性干预与新药开发研究的重要潜在靶标，为研发抗感染、治疗自身免疫性疾病的疫苗和药物提供靶点。*申请发明专利10项以上。*发表SCI论文50篇以上，其中高水平论文（影响因子＞5）30篇以上，在Nature系列、Cell系列及Science等一流杂志发表论文10篇以上。*培养教育部长江学者特聘教授、国家杰出青年基金获得者、或中科院“百人计划”级别的人才3名以上，全国“百篇优秀博士论文”获得者3人以上。通过本项目组成一支在天然免疫领域团结协作、吃苦耐劳、善于攻关的高水平研究队伍。三、研究方案（一）总体思路：本项目将采用多种手段和方法，系统鉴定一批新的参与天然免疫应答的相关蛋白，研究这些蛋白的结构、功能及作用机制。因为I型干扰素和炎症因子是天然免疫的关键介导因子，我们计划重点研究模式识别受体介导的I型干扰素和炎症因子表达的信号转导及其调节机制，鉴定由I型干扰素和炎症因子诱导的、新的天然免疫效应蛋白并阐述其调控网络。本项目将从分子、细胞、个体和结构生物学角度全面探索这些重要的天然免疫应答相关蛋白的功能及作用机制，并从整体角度揭示各信号通路间的相互作用及调控网络。（二）技术途径：1．筛选与I型干扰素和炎症因子诱导表达相关的信号蛋白和调节蛋白我们将用下述几种方法筛选与I型干扰素和炎症因子诱导表达相关的信号蛋白和调节蛋白：a)表达克隆（或功能克隆）：我们将采取基于报告基因实验的表达克隆方法，从人白细胞cDNA表达文库、单个的人和小鼠cDNA表达克隆(~13000个)中筛选能调节I型干扰素启动子、ISRE、转录因子NF-B活性的蛋白。我们将向293细胞中转染cDNA表达克隆和报告基因，然后对细胞施加仙台病毒（SeV）、单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）等病毒或细菌感染或不感染处理，用报告基因实验筛选能激活或抑制I型干扰素表达和转录因子NF-B激活的蛋白。b)生化纯化：I型干扰素诱导表达信号通路中的一些关键蛋白（如RLRs、TLRs、VISA、MITA、TRIF、TBK1、IKKs、IRF3等）已经被发现。但这些蛋白发挥作用的分子机制尚未完全阐明。我们将用串联亲和层析(TAP)结合质谱分析等方法筛选与这些关键信号分子相互作用的蛋白。c)候选法：我们将利用多种数据库，采用差异表达谱筛选技术（包括mRNA芯片技术、差异蛋白质组学技术等）、生物信息学方法结合文献搜索，预测和发现可能参与I型干扰素和炎症因子表达调控的候选分子。2.确定上述筛选出的蛋白是否在I型干扰素和炎症因子诱导表达中发挥作用当候选蛋白被发现后，我们将用多种生化、细胞及分子生物学方法从I型干扰素和炎症因子基因转录、蛋白翻译和抗病原微生物效应等多方面确定这些蛋白在病原微生物感染诱导I型干扰素和炎症因子产生过程中的功能及其在天然免疫应答中的作用，同时我们将检查候选基因发挥调控作用的信号通路特异性以及细胞选择性。我们也将在找到磷酸化蛋白、泛素相关酶的基础上，研究相关蛋白翻译后修饰在天然免疫应答信号传导中的作用。3.探讨筛选出的蛋白在天然免疫应答中的功能和分子机制a)我们将用改良的体细胞基因敲除技术构建靶基因缺陷细胞，用生化方法和细胞生物学方法确定筛选出来的蛋白在I型干扰素诱导表达信号转导通路的哪个步骤发挥作用，通过构建突变体和截短体进一步探讨这些蛋白调控I型干扰素诱导表达的分子机制。b)以VSV、SeV、E.Coli、Listeriamonocytogenes、M.tuberculosis感染为模型，分析新发现的PRRs及信号分子缺陷后病毒或细菌在小鼠体内的复制、炎症因子和I型干扰素产生以及小鼠存活期的变化，肯定新型PRRs和信号分子的体内功能，并探索其作用机制。c)以VSV、SeV、E.Coli、Listeriamonocytogenes、M.tuberculosis感染M或DC为模型，分析相应分子缺陷导致M或DC产生细胞因子、信号通路活化的变化，确定新型PRRs和信号分子的体外功能。d）基于进一步研究PRRs信号通路精确调控机制、发现PRRs信号通路交叉调控效应和机制的思路，运用新型PRRs和信号分子缺陷小鼠与经典TLR/RLR/NLR缺陷小鼠杂交，以VSV、SeV、E.Coli、Listeriamonocytogenes、M.tuberculosis感染为模型，通过体内体外实验观察信号通路交叉调控效应；运用野生型、相互作用结构域缺失或翻译后修饰缺陷等突变体转染M或DC，用VSV、SeV、E.Coli、Listeriamonocytogenes、M.tuberculosis刺激后，检测细胞因子产生、信号通路活化，并进一步分析相互作用分子和蛋白翻译后修饰，探索并发现新的调控机制。e）以M为模型，分析新发现的CLRs（C-型凝集素受体）缺陷后导致M产生细胞因子、信号通路活化的变化，同时分析CLRs与TLRs的交叉调控及其作用机制；以E.Coli、HBV感染小鼠为模型，分析新发现的CLRs及其信号分子缺陷后细菌或者病毒的清除以及相应炎症因子的水平变化，鉴定新型CLRs和信号分子的体内功能，并探索其作用机制。4.天然免疫效应蛋白的鉴定及其作用机理研究a)新天然免疫效应蛋白的鉴定及其作用机理我们将利用生物信息学、基因芯片系统全面鉴定能被I型干扰素和炎症因子诱导表达的基因。我们将着重以流感病毒和艾滋病病毒为研究对象，分析这些候选效应蛋白的抗感染功能、对病毒诱导产生I型干扰素信号转导通路的影响及其作用机理。同时，我们将深入研究这两种病毒如何逃逸这些特异的天然免疫效应基因对它们的影响。b)干扰素效应蛋白ZAP抗病毒机理及对干扰素信号通路的调节ZAP最初是通过高通量基因筛选的方法鉴定出的一种抗病毒基因，其表达受到干扰素的调控，属于干扰素效应蛋白。ZAP可以特异性地抑制多种病毒的复制，辅助RIG-I激活下游信号通路，促进I型干扰素的产生