CRISPR-Cas9的技术原理

CRISPR/Cas9系统及其应用CRISPR-Cas系统简介CRISPR-Cas系统的应用技术CRISPR-Cas系统的应用前景1.CRISPR-Cas系统简介1.1CRISPR-Cas系统的研究历史1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列2005年发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。2007年，Barrangou等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能2013年初，MIT的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定点插入。1.2CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列L(leader)以及一系列CRISPR相关蛋白基因cas。Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。1.3CRISPR-CAS系统的作用机理CRISPR的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM（NGG序列），将临近PAM的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR基因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间1.3CRISPR-CAS系统的作用机理CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。1.3CRISPR-CAS系统的作用机理2、CRISPR-Cas系统的应用2.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点2.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。Mali等人利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR相关蛋白Cas9，在一段人为重组的sgRNA(small-guideRNA)的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA进行DNA改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。例子：基因敲除的实验过程1、在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA并合成该序列。2、将该序列以及cas9基因连入如图所示载体。3、转化感受态，质粒小提，测序验证。4、细胞培养与细胞转染5、敲除效果检测。6、建立稳定敲除的细胞株2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ结合的能力。这种失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为DeadＣas9。将ｄCas9与gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ结合。如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ＤＮＡ配对利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的CRISPR－on系统。真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得。3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景3.1CRISPR-Cas9技术的优势而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。3.2CRISPR-Cas9系统的应用前景目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将３种主要生物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质）结合在一起的特殊能力。各种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用结合到dsＤＮＡ的任意位点，发挥人们预期的功能。例如：Cas9如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点Cas9复合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调控的目的。•完