(第八章)第九章植物原生质体培养与体细胞杂交.

第十章植物原生质体培养与体细胞杂交授课老师：韦鹏霄第十章植物原生质体培养与体细胞杂交第一节植物原生质体的定义及特点第二节植物原生质体培养的发展与意义第三节植物原生质体培养方法第四节体细胞杂交第一节植物原生质体的定义及特点1、植物原生质体的定义植物原生质体（plantprotoplast）：是指已脱除细胞壁的具有生活力的裸露的植物细胞。植物原生质体（protoplast）一词始用于Hanstein（1880），是指“通过质壁分离，能够和细胞壁分离的那部分细胞物质。”换言之，原生质体就是除去全部细胞壁的“细胞”，或原生质膜所包围的“裸露细胞”。原生质体——是指由细胞壁质膜所包裹起来的一个具有细胞原有的全部原生质及由它所构成的各种细胞器的一个“整体或单位”。第一节植物原生质体的定义及特点2、离体原生质体的特点（7点）经离体的原生质体有如下几个特点：（1）能够完全分离，便于操作控制。在悬浮液中完全分离，每个原生质体可看作一个纯粹单细胞，易于定量操作和控制。（2）原生质体的性能接近原细胞水平。在RNA和蛋白质合成能力及光合活性与原组织中的细胞水平接近。（3）能再生胞壁、分裂增殖和再生完整植株。（4）能同源或异源融合，为体细胞杂交材料。在诱导条件下，发生同源或异源融合，形成聚核体或杂核体。第一节植物原生质体的定义及特点（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的理想工具。（6）变异为单细胞，变异性状易纯。原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更纯。（7）易被破坏，便于内含物分离。内含物如核酸、蛋白质，酶等高分子物质及胞核、叶粒体、线粒体、液泡和膜等。第二节植物原生质体培养的发展与意义1、植物原生质体培养的发展简史从高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是“机械法”，即把细胞置于一种适当的质壁分离介质中，然后用利刃切割。在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如萝卜的根、黄瓜的中皮层等，应用这个方法可从它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。然而这个方法有明显的缺点：一是产量很低；二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。第二节植物原生质体培养的发展与意义1960年，Cocking证实了用“酶解法”由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。他使用了一种由疣孢漆斑菌（Myrotheciumverrucaria）培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁，然而进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年纤维素酶和离析酶投入市场后，植物原生质体培养才变成了一个热门的研究领域。第二节植物原生质体培养的发展与意义首先，用商品酶进行原生质体分离的是（Takebe）等（1968）。他们在分离烟草叶肉原生质体的程序中，依次使用上述两种酶。即先用离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。Power和Cocking（1968）证实，这两种酶也可以一起使用，这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，也就减少了微生物污染的机会。现在，多数研究都使用这种简化的“一步法”。第二节植物原生质体培养的发展与意义1971年，Takebe首次利用烟草叶片分离原生质体，并获得了再生植株。以后，随着各种商品酶的出现，植物原生质体培养取得了突飞猛进的发展。在作物上，如大豆（Wei和Xu,1988）、棉花（陈志贤等，1989）油菜（Spangenberg等，1986）等重要经济作用已成功地从原生质体再生成植株。特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987；Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱的原生质体培养都已相继成功。第二节植物原生质体培养的发展与意义木本植物原生质体培养的进展也很迅速。科学家们相继在柑桔（Vardi等，1982）、檀香（Rao等，1984）、杨树（Russel和Mocown，1988）、云杉（Attree等，1989）等木本植物上获得成功。据统计，目前已从分属49个科、160多个属的360多种植物的原生质体培养中获得了再生植株，未获再生植株的再生质体培养还有许多植物。第二节植物原生质体培养的发展与意义原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功（Spangenberg等，1986）。利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究也是有利的（Schweigo等，1987）。饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂（Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程的观察。第二节植物原生质体培养的发展与意义2、植物原生质体培养的意义（1）植物原生质体培养用于作物改良在作物改良上，常规育种至今还起着重要的作用。但常规育种有一定的局限性。通过原生质体融合后再生的杂种植株，可以克服远缘杂交中的不亲和性和子代不育等常规远缘杂交所难以克服的障碍。也有实验说明，通过体细胞杂交能转移在作物杂交育种上十分有价值的细胞质雄性核不育基因。这些都给农作物的改良带来了新的方法和希望。第二节植物原生质体培养的发展与意义（2）植物原生质体是植物遗传工程的理想受体原生质体由于没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，这就可能有目的地引入特定的有用基因，来定向地改造现有生物体的性状，包括农作物的产量性状和品质性状。特别是对于单子叶植物，由于缺乏天然的基因载体，在基因转化过程中，无法采用双子叶植物的基因转化系统。这样，原生质体就成了理想的受体。第二节植物原生质体培养的发展与意义（3）植物原生质体用于细胞器的分离与转移。分离的原生质体由于没有细胞器的障碍，可以进行许多遗传操作研究。用原生质体作材料可以分离制备细胞内的各种细胞器，如叶绿体、线粒体、细胞核和染色体等。这对于研究这些细胞器的结构、功能、生理生化特性，以及进行分子生物学分析十分方便。原生质体摄取了这些物质之后，其遗传结构和功能有可能也会发生相应的改变，经培养再生的植株会出现一些新的性状，并能遗传下去，这就为植物优良性状的筛选和品质改良提供了丰富的源泉。第二节植物原生质体培养的发展与意义（4）植物原生质体用于有关理论研究。植物原生质体由于只有细胞膜包裹，可以用来研究细胞壁的再生、细胞膜的离子转动以及病毒侵染的机理等问题。由于原生质体在人工培养的条件下，可以再生细胞壁，进而产生植株，故可以深入探讨再生壁的生物化学特性，以及培养条件下对于再生壁的原材料的合成、运输与装配的影响。近30年来，植物原生质体研究不仅已成为细胞生物学、生物技术等学科中发展较快的一个分支。而且通过多方向的探索，原生质体培养技术已在生理学、遗传学、病理学、病毒学和育种学等研究中得到了广泛应用。第三节植物原生质体培养方法一、植物原生质体的分离（一）植物原生质体的分离方法主要有机械法和酶法两种：1、机械法分离原生质体（1）步骤：分2步①第一步：是将植物组织或细胞置于高渗糖浓液中，让细胞产生质壁分离；②第二步：用“机械法”磨碎组织或切破细胞壁，让原生质体释放出来。（2）优缺点①优点：可排除外加酶对原生质体结构和代谢活性的有害影响。②缺点：原生质体产量太低，而且对难以产生质壁分离的分生细胞无能为力。第三节植物原生质体培养方法2、酶法分离原生质体：即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶胼胝质酶、EA3-867酶等。国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研究所产）。第三节植物原生质体培养方法（1）优缺点（与“机械法”比较）①优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有植物或它们的器官、组织或细胞均可用此法获得原生质体。②缺点：是不纯的酶制剂所含杂质（如核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质）会对原生质体有不同程度的毒害作用，影响所获原生质体的活力。第三节植物原生质体培养方法①顺序法（“二步法”）材料果胶酶液分离单细胞纤维素酶液去壁原生质体即先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，后用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。图示如下：材料分离果胶酶液单细胞纤维素酶液去壁原生质体第三节植物原生质体培养方法（二）植物原生质体的分离程序以“酶法一步法”为例：主要考虑到取材、酶的种类及纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等等。1、取材植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片。因为叶片中可以分离出大量比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。第三节植物原生质体培养方法当由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要。为了能最大程度上控制供体植株的生长条件，一些人使用了离体培养的植物，对这类片无需进行表面消毒。一些人则使用温室或生长室栽种的植物，在此，一般以生长在下述条件下的植株能产生较好的结果：低光照强度（1000uW/cm2），短日照，温度20～25℃,相对湿度60～80%。由于从禾本科和其它一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生质体相当困难，因此，在这些植物中一直用培养细胞作为供体材料，频繁继代（3～5天1次）的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料。第三节植物原生质体培养方法2、酶的种类及纯度原生质体的游离，在很大程度上取决于所用酶的种类及纯度。用来使细胞分离并降解细胞壁的酶制剂主要有：（1）纤维素酶类：为从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其作用是使细胞壁的纤维素降解，得到裸露的原生质体。（2）果胶酶类：是从根霉和黑曲霉中提取的，可以降解中胶层，使细胞从组织中分离出来。（3）半纤维素酶类：常用的商品酶制剂：第三节植物原生质体培养方法3、酶液渗透压离体原生质体的一个基本属性是它们的渗透破碎性，因而在酶溶液、原生质体清洗介质和原生质体培养基中必须加入一种适当的渗透压稳定剂。常用的酶液渗透压稳定剂有糖溶液系统和盐溶液系统两种。第三节植物原生质体培养方法（1）糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。其优点是分离出的原生质体能再生细胞壁，并能继续分裂。在原生质体再生完整植株的实验中，绝大多数采用糖溶液系统。其缺点：是这几种糖有抑制某些多糖降解酶的作用。目前，广泛使用的渗透压调节剂是山梨醇和甘露醇，浓度约在0.4～0.8mol/L。第三节植物原生质体培养方法（2）盐溶液系统：用2.5%KCI、1%MgSO4特点：①用盐作渗透压稳定剂，获得的原生质体可以不受植物生理状态的影响。可在不严格控制条件下栽培，而用糖系统的材料需栽培在气候箱中。②盐系统不受材料年龄限制，甚至见到花芽的成熟植株也可采用。③盐系统使某些酶有较大的活性。（为获同样去壁效果，13%甘露醇代替盐溶液，纤维素酶浓度要提高3倍。）因此，近些年来，多采用在盐溶液系统中分离原生质体，而在糖溶液系统中培养原生质体。第三节植物原生质体培养方法二、植物原生质体的纯化及活力鉴定（一）原生质体的纯化供体组织经酶解处理后，得到一种由原生质体、细胞团和细胞碎片等组成的混合液。只有将杂质和酶液去除，使原生质体纯化，才能进行培养。第三节植物原生质体培养方法效果较好的提纯方法有：1、