05标记Ph和蛋白量

备注：此讨论为NaCl滴定法，其缺陷详见涛哥答疑录。问：最佳PH值试验步骤：①先取5个EP管（进口），各取1ml粒径为23nm左右的最新制的胶体金，用0.1M碳酸钾调Ph值，由精密试纸进行确定，最后发现以下关系：pH值678910加入碳酸钾量07ul12ul14.5ul26.5ul②之后再重新取五个EP管，加1ml胶体金，再按上面的关系加对应的体积的碳酸钾，调好相应的Ph值；③再直接在里面取200ul胶体金加到另外五个EP管中，然后在每管中加4ul的浓度为2mg/ml的抗体；④过十分钟后再加40ul10%NaCl，再静待颜色的变化。结果很奇怪：从左到右的PH是678910。是金的问题、试剂的问题、抗体的问题、还是步骤的问题？T：一般情况下是抗体的问题。再者：200ul胶体金加4ul的浓度为2mg/ml的抗体，标记量高了。标记量要通过具体试验来确定。一般5-20ug/ml，跟方法学、实际需要和原料性质有关。0ug/ml？还是mg/ml啊？像我这种只是做做实验而已的，一般浓度多少？好像浓度不一样对结果影响很大吧？我换别的不同金现结果变了，应该是金的问题吧？图片在下面：T：不同的胶体金颗粒和不同的质量，对抗体的结合差别也是很明显的。我说的是实际标记量，每毫升胶体金结合5-20ug抗原/抗体，而不是抗原/抗体的使用浓度。如果仅仅是做做实验，可以每毫升胶体金标记15ug抗原/抗体。出现以上现象，并不能简单的说是抗体有问题或者胶体金有问题，可以通过性能实验来确定，胶体金和抗体是否可用。0抗体是新买来的，做出来的结果也是这样和之前的抗体一样，换了胶体金之后就好了。也就是说不同的抗体结果一样都是有问题的，一换胶体金之后结果就变了，变得正常了。还有，我最近用那个ph=8的结果来做最小蛋白量的测定，结果EP管的颜色如下图：①每管有200ul胶体金（ph=8)(经精密试纸测得，碳酸钠12.5ul加入1000ul胶体金中即可配到)；②然后抗体的浓度是2mg/ml。③我现将每管的蛋白质量算好如下：0、0.8、1.0、1.2、2.4、3.0、4.0、5.0、6.0（ul）共九管。④体积则为质量浓度之比换算而得⑤加入抗体后再反应5--10分钟再加入40ul10%NaCl得到的图像如下：T：每个人操作方法可能有差异，但是你的操作没有大的问题，从最后一张图片上看试验结果也没有问题。你换了胶体金之后，结果出现异常的话，很可能跟胶体金的粒径或质量有关。0可能是照相的问题，我这边看到的是第二开始都不变色，我师姐他们做的都有渐变的过程。1.从结果看，你的第二个条件已经是饱和的了，再以后的结果都不能说什么了；你可以考虑在前三个梯度间继续细化，趋势就好看出来了。0好像好点了，是不是一般测得的最佳PH是9？而最小蛋白量是1ml金中标记10ug?还有，测最佳PH的时候用的抗体的体积，是随便取的吗？我用的是4ul2mg/ml的抗体这样有问题吗？T：最低标记量和最佳标记PH是通过试验确定的，你最好做个棋盘滴定。0最低标记量的时候最佳PH已经测出来了，这没什么。可最佳PH测定的时候最低标记量还不知道啊~~~这时候最低标记量应该用多少啊？2.楼上的意思，我没听明白。棋盘滴定，标记量和标记PH同时做，结果一起出来。0棋盘滴定一般用于ELISA吧？胶体金也适用吗？还有，我们用的常规方法就是在不确定最小蛋白量的时候测定最佳PH值时取蛋白的值比如4ul2mg/ml，这样可行吗？T：所谓“棋盘滴定”，只不过是双因素多水平的全面试验而已，不受方法学限制，ELISA、胶体金都是可以用的。