12-结构生物学导论-5.

电子密度图的解释和结构修正电子密度函数(xyz)=（1/v）∑∑∑Fhklexp[-2i(hx+ky+lz)]hklFhkl=|Fhkl|exp(ihkl)Fourier加和,采用用快速Fourier变换技术通常在三维晶胞中按dmin/3的格点进行计算分析电子密度图→二级、三级、四级结构结构模型，原子坐标(不包括H原子)晶体结构的分辨率2dminSinmax=dmin=/2理论极限衍射分辨率分辨率描述结构的精细程度分辨率和hkl指数大小相关-螺旋6Å5Å4Å3Å2Å-折叠片6Å5Å4Å3Å2Å3Å1.6Å不同分辨率电子密度图提供的结构信息低分辨率5~6Å分子形状、大小、非晶体学对称性中分辨率2.5~3.5Å跟踪肽链、二级结构、侧链取向高分辨率1.5~2.0Å侧链的精细结构、活性中心精细结构、辅基、有序溶剂分子、其他小分子和离子结构修正•晶体结构修正的目的和任务•结构可靠性的判据•修正方法结构模型误差的来源•生物大分子结晶不完善，导致：衍射强度低，误差大衍射数据分辨率有限•相角推算过程引入的误差•电子密度的解释和模型构建过程引入的人为的误差晶体学修正的目的调整结构参数改进结构模型与衍射数据之间的吻合程度同时保持结构模型的立体化学合理性F(hkl)=K∑qjfjexp[2i(hxj+kyj+lzj)-Bj(Sin/)2]jF(hkl)=|F(hkl)|exp[i(hkl)]结构参数(H除外)：坐标xjyjzj占有率qj热参数Bj（各向同性）结构可靠性判据•R因子和Rfree•立体化学参数与理想值的偏差•多肽链构象角的合理性（Ramachandranplot）R因子R=∑||Fo|-|Fc||/∑|Fo|hklhkl观测值计算值代表结构的精确程度正确的初始模型：R≤0.4-0.5修正后的模型：R≤0.30~分辨率Rfree交叉验证衍射数据分为2组：从可观测衍射数据中随机选取的约5%T其余衍射数据A工作数据（A）用于结构修正检验数据（T）用于交叉验证,不参与结构修正R=∑||Fo(h)|-k|Fc(h)||/∑|Fo(h)|(hklh)h∈ARfree=∑||Fo(h)|-k|Fc(h)||/∑|Fo(h)|h∈TRfree比R更可靠和客观(RfreeR,通常差值0.05)同时监测R和RfreeRfree约保存在分辨率+0.2立体化学参数•键长与理想值的均方根偏差rmsd0.010Å•键角rmsd1.8•手性中心（如C）原子的手性氨基酸L构型•非成键原子间的接触距离（如氢键、盐桥）在减小R因子的同时，应保持立体化学参数接近理想值多肽链构象角Ramachandranplot～CNS流程generate蛋白质结构文件（mtf）工作数据A和检验数据T初始坐标topology*.topParameter*.parslowcoolingSA位置修正Brefinement热参数修正map手工模型重建后期加水第二轮修正后新坐标衍射数据make_cvCNS精修基本的基本步骤make_cv.inp第一轮修正前衍射数据的准备generate_easy.inp产生mtf文件rigid.inp刚体修正(分子置换法需要)anneal.inp坐标修正bindividual.inp温度因子修正新坐标Model_map.inp(u=2,v=1)2fo-fc电子密度图Model_map.inp(u=1,v=1)fo-fc电子密度图Model_stats.inp统计结果sa_omit_map.inpsa_omit电子密度图(后期用于检查可疑片段)water_pick.inp帮助寻找水分子•如果存在非晶体学对称性(NCS),精修过程应用NVSrestraint,后期可放开•protein.top,protein_rep.param,water.top,water_rep.param:CNS库文件复合物中的小分子的topopoly和parameter文件的查询或建立可求助网站:•应按分子图形软件的要求,对电子密度图文件进行必要的格式转换手工模型重建使用的各种电子密度图常用的电子密度图:(2Fo-Fc)map,(Fo-Fc)map,SA-omitmap(xyz)=(1/V)∑|Fhkl|exp(ihkl)[-i2(hx+ky+lz)]hkl模型2|Fo|-|Fc|map应与模型一致(用于修正全过程,通常等高线1.0)|Fo|-|Fc|map正值表示模型该处缺少原子负值表示模型该处有多余原子(通常用于精修的中后期,通常等高线±3.0)|Fo|-|Fc|SA-omitmap模型中略去可疑片段后进行模拟退火SA修正显示该片段的客观的电子密度(用于精修后期纠正可疑片段,通常等高线±3.0)手工模型重建是必要的利用分子图形软件进行：如COOT纠正主链走向的局部错误,纠正侧链错误,加入溶剂分子,其他小分子和离子重建前重建并再修正后Trp222侧链糖Trp222蛋白质晶体结构测定的方法步骤•单晶生长单晶•初步晶体学研究空间群，晶胞参数分子数，分辨率•X-射线衍射数据采集HKLII|F|•解决相角问题•电子密度图的解释和初始结构模型的建立(xyz)初始模型•结构精修精确结构(原子xjyjzjqjBj)•分析结构特点功能、机理复合物、突变体