12第十二讲蛋白质分子设计.

第十二讲蛋白质分子设计（一）一、概述二、部分氨基酸突变三、天然蛋白质剪裁四、蛋白质分子全新设计1.蛋白质分子设计的概念和意义2.蛋白质设计的分类3.蛋白质设计的基础4.蛋白质分子设计的流程5.蛋白质分子设计思路6.本节小结第一节概述一、蛋白质分子设计的概念和意义1、概念实现蛋白质分子改造目标的一整套方法、计划、措施和指导方针。以蛋白质结构和功能的关系为基础，通过蛋白质模型和结构预测等方法，构建具有新功能的蛋白质模型的技术。如何理解？分子设计包括：目标、思想、程序、方法、措施、验证和分析一系列过程。是蓝图—如：建筑工程的设计蓝图—宏伟构思和诱人的前景是理论—理论上的设计——指导实践过程是实践—实践上的验证——提出问题与建筑工程的蓝图不同——实施验收(也有豆腐渣工程——不是设计的问题)是设计—实践—验证—再设计—再实践—再验证的过程是一个设计—验证反复进行的过程。获得新功能蛋白质分子及其分子模型2、意义：（通过分子设计、人工改造蛋白）理论上：解析蛋白质结构和功能关系实践上：满足生产实践的需求蛋白质分子设计是蛋白质工程领域的核心问题与前沿领域是一门新兴的研究领域，是众多学科的交叉结构生物学、信息生物学、分子生物学、蛋白质化学、细胞生物学、免疫学等随其他学科的发展而不断地发展，其内容也在不断地更新。设计和实践成功的实例：DNA结合蛋白、血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白理论上：解析蛋白质结构和功能关系？为什么组成天然蛋白质只20种氨基酸，却具有高度多样性，功能如此广泛又各不相同？？蛋白质一级结构与高级结构的关系？？蛋白质高级结构与功能的关系？？蛋白质一级结构与功能的关系？2、意义——理论上：•天然蛋白的缺陷–生物进化过程中，自然选择了数量众多、种类各异的天然蛋白质。–天然蛋白质在特定的条件下应用，(适合于生物环境)•改造蛋白的优势工业生产—高温高压条件，其结构和功能改变，达不到理想的效果。为了更好地发挥蛋白质的作用，需要对蛋白质进行人为改造。–如：药物、食品工业和污水处理中的酶、疫苗、生物传感器等进行蛋白分子设计改造，发挥良好的作用。–如：经改造稳定性好的酶，可从价格便宜的棕榈油中生产出价格昂贵的可可脂，创造很高的经济效益。2、意义——实践上：–如：荷兰一家公司设计了一种与漂白剂一同起作用的去污酶（对酶上两个氨基酸修改，使这种酶具有较高抵抗力），在洗涤过程中不受破坏。–如：医学上，蛋白质工程也具有广泛的应用前景。比如，用人工手段去改造蛋白质，开辟了诊断和治疗癌症的新途径。单链抗体—核素——免疫影像？单链抗体—毒素——免疫治疗？•我国的蛋白质工程达到国际先进水平，–如：重组人胰岛素和溶血栓药物、重组人尿激酶等。–对这些蛋白质改造离不开蛋白质分子设计。•因此，蛋白质分子设计在生产实践中具有重要意义二、蛋白质设计的分类包括两种分类方式1、根据对蛋白质改造的程度分为三类第一类为“小改”，即通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，即不同蛋白质的结构域进行拼接组装，改变蛋白质的功能特性的方法；——如：蛋白质融合技术实现第三类为“大改”，即全新设计具有特定功能的蛋白质——仿生2、根据改造对象分为两类基于天然蛋白质结构的分子设计全新蛋白质的分子设计3、两种分类方法是统一的三、蛋白质设计的基础理解（一级结构—高级结构—功能的关系）——蛋白质分子设计的基础理解结构是功能的基础——蛋白质独特的性质和功能是其特定结构的反映。1、蛋白质一级结构是空间结构的基础（理解2点）每一种天然蛋白质生物学活性，决定于蛋白质的结构特点20种aa各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，可形成多种多样的空间结构，具有不同生物学活性。一级结构不同，蛋白质功能和活性存在差异，甚至完全不同。每种蛋白质具有特定的结构，执行其特定的功能–甚至一级结构上个别aa变化→特定功能的丧失或改变。–最经典的例子：镰刀型红细胞贫血病，即患者Hb2条β链第6位Glu→Val–蛋白酶：个别aa突变（关键aa），酶活性丧失*要求：查找一级结构中个别氨基酸突变蛋白，功能改变的实例2、蛋白质空间结构直接决定蛋白质的功能一级结构不能完全了解蛋白质分子的生物学活性和理化性质多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲构成特有的稳定的空间结构蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整性？去折叠——变性，一级结构未发生改变—功能完全丧失—空间结构的作用？蛋白质去折叠的方法——物理、化学因子蛋白的性质和功能，很难仅用蛋白质的一级结构的排列顺序来解释理解蛋白空间结构和功能关系对蛋白质分子设计才是最重要的蛋白质一级结构——高级结构——功能关系，是蛋白质分子设计的基础蛋白质分子设计面临的挑战虽然解析蛋白质的结构逐年增加，但依然无法满足蛋白质分子设计的需要？现有蛋白质的分子设计大多数主要依据一级结构。——一次性成功的把握很小？四、蛋白质分子设计的流程蛋白质分子设计——庞大工程蛋白质分子设计程序构建原蛋白质模型建立和优化突变体模型获得蛋白质的突变体结构和功能分析验证新的结构和功能的蛋白质•通常，需要几次循环才能达到目的蛋白质分子设计流程需要计算机专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家相互配合需要理论设计和试验过程相结合，才能达到改造蛋白质的目的。1、设计构建蛋白质突变体模型收集素材——构建原蛋白质模型：掌握和了解蛋白质的一级结构、高级结构、功能域，理化特性、结构和功能的关系、以及同源蛋白的相关信息。数据来源：查阅文献和相关数据库。对于已知结构蛋白质，同源建模法或直接构建模型。未知结构的蛋白质，要么先解析其晶体结构，要么根据已知的氨基酸序列进行结构预测。设计突变体——建立突变体模型——借鉴现有的经验（规则）改变蛋白质结构：优化蛋白的稳定性、抗氧化性、对重金属稳定性、pH稳定性、酶学性质如：Hartley等（1986年）完成有关蛋白质一些重要性质的设计目标及解决办法表具有一定的参考价值。（Next）考虑不同氨基酸对蛋白质二级结构的影响（第七讲结构预测）Chou和Fasman对29种蛋白一级结构和二级结构之间的关系进行统计分析，发现：a—螺旋最强生成者：Glu、Met、Ala、Leu；最强破坏者：Gly、Pro；β-折叠最强生成者：Gly、Ala、Ser；β-转角最强生成者：Gly、Pro、Asp、Ser；最强破坏者：Ile、Val、Leu。蛋白质重要性质设计目标及解决办法设计目标解决办法Hartleyetal.（1986）思考：为什么能改善蛋白性质2、建立和优化突变体模型（能量优化以及蛋白质动力学分析）利用能量优化以及蛋白质动力学分析的方法——预测修饰后的蛋白质的结构将预测结构与原始蛋白质的结构比较利用蛋白质结构—功能或结构—稳定性相关知识预测新蛋白可能具有的性质和功能3、获得蛋白质突变体•蛋白质分子设计仅停留在理论层面上，没有试验证据，这种设计是没有任何意义的。•根据设计，合成蛋白质，或改造蛋白质突变体的基因序列，表达突变体蛋白，然后分离、纯化得到所要求的蛋白质。•获得突变体的方法和手段（详见：蛋白质纯化与克隆修饰）–分子生物学方法：获得基因、定点突变、导入宿主细胞、表达基因的产物—蛋白质–分离纯化：采用分离纯化的方法—分离突变蛋白质—测试→4、结构和功能分析——蛋白质分子设计的流程•对纯化的蛋白质突变体进行结构和功能的分析和测试，•与原蛋白质比较，是否达到预期改造的目的。•若得到的蛋白质突变体没有实现预期的功能，则需要重新设计和改造；•若达到预期，则获得一种具有特定功能的新蛋白。蛋白质分子设计是一门试验性科学，是理论设计过程与实验过程相结合的产物。理论设计与实验过程两部分相辅相成，才构成了蛋白质分子设计的全过程。再深入理解：（符合认识论的过程——实践—认识—再实践—再认识的过程）学习与知识（知—识）的应用过程（掌握规律、利用规律、改造自然、做自然的主人）遇到问题、思考问题、采取对策、解决问题的过程做一个实验：设计—实验—再设计—再实验任何事情：仅仅停留在理论层面上是毫无意义的!认识具有能动性意识对物质具有反作用只要精神不滑坡，办法总比问题多体会——深刻理解：试验性科学=理论设计+实验验证（一）获得原蛋白质的结构与功能信息一级和高级结构、功能结构域、同源蛋白、基因、理化性质（二）建立原蛋白分子的结构模型（原蛋白结构模型）模型来源：PDB或文献实验测试三维结构—衍射、NMR……预测：如：同源蛋白进行三维结构预测（三）结构模型信息分析结构特点——模体——结构域功能活性区域及分布影响因素二硫键数目和位置（四）选择设计目标（依据和实践经验）（确定突变位点或序列，功能区二硫键数目和位置）五、设计思路（9个步骤）（五）突变体（序列）设计设计的原则1.充分考虑氨基酸的极性，以利于形成特定的空间结构α-螺旋（LeuGlu），β-折叠（ValIle），β-转角（ProGlyAsn)2.充分考虑氨基酸的排列顺序，以利于形成次级键构成空间结构设计的基本方法（下周详细讲述）1.序列最简化法：少数几个氨基酸设计的序列，往往具有一定的对称性和周期性，从而减少设计的复杂性，并能检测到一些蛋白质折叠的规律和方式。2.模板组装合成法：将各种二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的模板分子上，形成一定的三级结构。绕过了蛋白质三级结构中的氨基酸残基来研究蛋白质中长程作用力，是研究蛋白质折叠和进行蛋白质全新设计规律摸索的有效手段。（六）构建和预测突变体模型→初步检验→修正设计结构模型二级结构预测方法：依据信息论和概率统计（ChouFasman法；Garnier方法；Cohen方法）三级结构预测方法和构象搜索方法：依据基团之间相互作用的能量最低原理研究者具备的素质：硬件（计算机软件、高质量立场）；软件（结构化学、物化和背景知识）；专业知识（七）获得新设计的蛋白质（合成新设计的蛋白质）多肽化学合成法（固相合成技术）获得新蛋白质基因工程手段：PCR等基因操作-构建突变体-表达-分离纯化-新蛋白质。（八）新蛋白质的检验是否有多聚态？是否与设计吻合？是否有三级结构？功能活性？（九）完成新蛋白质的设计反复设计—反复修改——反复试验→达到预期目标纸上谈兵成本低廉本节小结1、蛋白质分子设计：通过蛋白质模型和结构预测来构建具有新功能的蛋白质2、分子设计分类：根据对蛋白质改造的程度、根据改造对象分为两类不同，蛋白质分子设计分为三类3、掌握蛋白质分子设计的程序建模→优化→获得突变体→结构和功能分析4、掌握蛋白质设计思路（试验性科学=理论设计+实验过程）①获得蛋白质结构与功能信息②建立分子设计的结构模型③结构模型信息分析④选择设计目标⑤突变序列设计⑥预测结果→初步检验正确度→修正设计结构模型⑦获得新蛋白质（合成新设计的蛋白质）⑧新蛋白质的检验⑨新一轮蛋白质的设计第二节部分氨基酸的突变•部分氨基酸的突变——又称“小改”，是基于对已知蛋白质的局部改造。–是目前蛋白质工程中使用最广泛的方法。•思路：设计目标分子→基因序列或cDNA序列→定点突变→载体系统→宿主细胞表达→特定改变的蛋白质分子→突变体与野生型蛋白性质比较•目的：–改变蛋白质的性质和提高蛋白质活性•蛋白质的热稳定性、酸碱稳定性、增加活性、减少副作用、提高专一性–阐明蛋白质的结构和功能的关系•关键的问题：如何恰当地选择要突变的位点（aa残基）。•解决问题的手段：通过蛋白分子设计——分析蛋白质中残基的性质，借助于已有的蛋白质三维结构或分子模型分析。（详见以下五方面阐述）部分氨基酸改造——从以下五方面选择“突变”位点——针对不同的情况和目的，采取5种不同的改造方法•根据结构信息确定突变的位点（碱基）•随机突变•缺失突变和接头分区突变•根据蛋白质的同源性确定功能残基•选择翻译后修饰位点突变一、根据结构信息确定突变位点已知高级结构的蛋白：（X射线晶体或NMR谱高分辨率）根据氨基酸残基在蛋白质结构上的位置来推测其功能。如果已知蛋白质及其配基复合体的结构（包