13固定化细胞发酵.

第十三章固定化细胞发酵（Fermentationwithimmobilizedcells)第一节概述一、定义•固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。二、固定化细胞的优点1，与游离细胞相比•固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应•可以获得更高的细胞浓度；•细胞可以重复使用；•在高稀释率时，不会产生洗脱现象；•单位容积的产率高；•提高遗传稳定性；•细胞不会受到剪切效应的影响。•发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。2，与固定化酶相比•免去了破碎细胞提取酶的手续•酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少•固定化细胞制备的成本比固定化酶低•无需辅酶再生三、固定化细胞的缺点•仅能利用胞内酶；•细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；•载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；•可能有副反应。四、固定化细胞的分类1，按细胞类型分为三类：•微生物•动物•植物2，按生理状态分为两大类•死细胞：完整细胞、细胞碎片、细胞器。适用于一种酶催化的反应。•活细胞：增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。第二节细胞固定化的方法•Adsorption（吸附）•covalentbonding（共价结合）•Crosslinking（交联）•Entrapment（包埋）、Encapsulation（微胶囊）一、吸附法1，原理•利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力（vanderWallsforces），使细胞吸附于载体上。吸附法可分为物理吸附和离子吸附两种。该法操作简单，固定化过程对细胞活性影响小。2，载体的材料•硅藻土•木屑•多孔玻璃•活性炭•多孔陶瓷•离子交换树脂•塑料3，影响吸附固定化的因素Z-电位细胞的性质和细胞壁的组成载体的性质pH二、共价结合法•利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。用该法制备的固定化细胞一般为死细胞。三、交联法•利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）反应，从而使细胞固定。•常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺。•由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。四、包埋法•包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可以分为：–微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；–凝胶包埋法：是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经过相应的造粒处理，形成直径为1-4mm的胶粒。•常用的包埋剂为：聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二醋酸纤维、三醋酸纤维、明胶等。五、固定化方法的比较•吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。•共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。•交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。•包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。第三节固定化细胞的形状及性质一、形状•固定化细胞由于其用途和制备方法不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状等。但目前大多数制备成颗粒状珠体。二、性质•最适pH：细胞经固定化后，其最适pH因固定化方法不同而有一些调整。•如，用聚丙烯酰胺包埋的大肠杆菌中的天门冬氨酸酶和产氨短杆菌中的延胡索酸酶的最适pH向酸性范围偏移。但用同一方法包埋的大肠杆菌中的青霉素酰胺酶的最适pH则没有变动。•温度：类似与pH，细胞固定化方法不同，也有可能导致最适温度产生不同的变化。•稳定性：一般而言，细胞经固定化后，其稳定性会有所提高。第四节固定化细胞反应器一、固定化细胞反应器的优点•在固定化细胞反应器中采用高稀释率有以下优点：–生产强度、转化率高；–与衡化器相比，固定化细胞反应器具有更好的稳定性；–节省投资和能耗。InhibitorentersinletfeedImmobilisedbioreactorChemostatTimeBiomassAhighercellconcentrationintheimmobilisedbioreactorpreventsthemicrobialpopulationfromcompletelywashingout.二、固定化细胞反应器的类型•细胞再循环系统（Cellrecyclesystems）•填充床反应器（Fixedbedreactors）•流化床反应器（Fluidizedbedreactors）•絮凝细胞系统（Flocculatedcellsystems）1、细胞再循环系统•Inafermenterwithcellrecyclethecellsareseparatedfromtheeffluentandthenrecycledbacktothefermenter;thusminimisingcellremovalfromthefermenterEffluentBiomassrecycleFermenterFreshfeedBiomassseparationsystemCellrecyclesystemCellrecyclesystems•Cellrecycleisusedinactivatedsludgesystems.Aportionofthecellsareseparatedinasettlingtankandreturnedtotheactivatedsludgefermenter.•Biomassrecyclingforproductorbiomassproductionismoredifficultduetotheneedformaintainingsterilityduringcellseparation.Centrifugationwhichisafasterprocessthansettlingwouldbeusedtoseparatethecells.•Biomassrecyclesystemscanbeeasilymodelled.2、固定床反应器•Infixedbedfermenters,thecellsareimmobilizedbyabsorptiononorentrapmentinsolid,non-movingsolidsurfaces.Fixedbedreactors•Inonetypeoffixedbedfermenter,thecellsareimmobilizedonthesurfacesofimmobilesolidparticlessuchasplasticblocksconcreteblockswoodshavingsorfibrousmaterialsuchasplasticorglasswool.•Theliquidfeediseitherpumpedthroughorallowedtotrickleoverthesurfaceofthesolidswheretheimmobilizedcellsconvertthesubstratesintoproducts.Fixedbedreactors•Oncesteadystatehasbeenreachedtherewillbeacontinuouscelllossfromthesolidsurfaces.Thesetypesoffermentersarewidelyusedinwastetreatment•Inothertypesoffixed-bedfermenters,thecellsareimmobilizedinsolidifiedgelssuchasagarorcarrageeninFixedbedreactors•Inthesefermenters,thecellsarephysicallytrappedinsidetheporesofthegelsandthusgivingbettercellretentionandalargeeffectivesurfaceareaforcellentrapment.•Inordertoincreasethesurfaceareaforcellimmobilization,someresearchershaveinvestigatedtheuseofhollowfibresandpleatedmembranesasimmobilizationsurfaces.•IndustrialapplicationsoffixedbedreactorsincludewastewatertreatmentproductionofenzymesandaminoacidssteroidtransformationsFixedbedreactors•Oneadvantagefixedbedreactorsisthatnon-growingcellscanbeused.•Insuchsystems,thecellsenzymaticallyactonsubstratesinthefeed.•Thecellscanbeeitherinactivatedornotfednutrientsrequiredforgrowth.3、流化床反应器•Influidized-bedfermentersthecellsareimmobilizedonorinsmallparticles.•Theuseofsmallparticlesincreasesthesurfaceareaforcellimmobilizationandmasstransfer.•Becausetheparticlesaresmallandlight,theycanbeeasilymadetoflowwiththeliquid(ie.fluidised).SmallmovingparticlesFluidisedbedreactorsFluidizedbedreactors•Thefluidisationoftheparticlesinthereactorleadstothesurfaceoftheparticlesbeingcontinuouslyturnedover.Thisalsoincreasesthemasstransferrate.•Fluidisedbedsaretypicallycategorizedaseitherbeinga2phasesystemwhicharenotaeratedand3phasesystemwhichisaeratedbysparging•Fluidizedbedbioreactorsareusedwidelyinwastewatertreatment.Fluidizedbedreactors•Fluidizedbedbioreactorsarealsousedforanimalcellculture.•Animalcellsaretrappedingelsoronthesurfaceofspecialparticlesknownasmicrocarriers.•Fluidizedbedreactorsareoneexampleofperfusionculturetechnologyusedforanimalcellculture.Comparingfluidisedbedandfixedreactors•Fluidisedbedreactorsareconsiderablymoreefficientthanfixedbedreactorsforthefollowingreasons:1)Ahighconcentrationofcellscanbeimmobilizedinthereactorduetothelargersurfaceareaforcellimmobilization