第八章 微生物的遗传变异学

第八章微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础第二节微生物的基因组结构第三节质粒和转座因子第四节基因突变及修复第五节基因重组第六节微生物育种第七节菌种的衰退、复壮与保藏遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能，变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（10-5~10-6）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总和。表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。饰变（modification）：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：Serratiamarcescens的红色素在25℃和37℃的变化。研究微生物遗传的意义微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883~1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌———小鼠死亡抽取心血分离活的S菌一、三个经典实验（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜（2）细菌培养实验热死S菌—————不生长活R菌—————长出R菌热死S菌+活R菌—————长出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液————长出大量R菌和少量S菌以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。（二）噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。（三）植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。元病毒的发现和思考元病毒含有微量的核酸，仍未发现？元病毒仅由蛋白质构成元病毒的遗传物质为蛋白质？第二节微生物的基因组结构基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。微生物的基因组一般较小，见P137原核生物（大肠杆菌）的基因组紧密缠绕的环状双链DNA分子遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝基因组的重复序列少而短真核生物（啤酒酵母）的基因组DNA与组蛋白构成染色体有间隔子或内含子序列没有明显的操纵子结构含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）遗传丰余：较高同源性的DNA重复序列古细菌（詹氏甲烷球菌）的基因组古细菌的基因组结构类似于细菌，即在环形DNA分子上功能相关的基因组成操纵子结构，无内含子序列。负责信息传递功能的结构（复制、转录和翻译）类似于真核生物，如启动子结构、复制起始因子、RNA聚合酶、翻译延伸因子等第三节质粒和转座子原核生物的质粒定义：是一类小型共价闭合环状核外DNA，能独立于细胞核进行自主复制。可以通过交换掺入细胞核成为附加体；可以从寄主细胞中消除。近年来也发现了线性双链DNA质粒和RNA质粒大小：2~100×106Da，含有数个到数十个甚至上百个基因。性质：质粒是一种复制子，分为严紧型和松弛型，严紧型质粒的复制受细胞核控制，一般一个寄主细胞内有2~3个；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在细胞内的数量可以达到10-15个功能：进行细胞间接合并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。原核生物的质粒存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、StreptococcuslactisAgrobacteriumtumefaciensetal制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法几种代表性质粒：1.F-因子（fertilityfactor）致育因子/性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。2.巨大质粒（mega质粒）为近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200~300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。3.Ti（毒性）质粒（tumoeinducingplasmid）即诱癌质粒。长200kb，是一种大型质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有Ti质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放至植物细胞中。含有复制子的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要形状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。4.Col因子（colicinogenicfactor）产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。有些G+细菌也产生细菌素，如用于食品保藏的NisinColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA的研究和用于体外复制系统上。5.R（抗生素抗性和重金属抗性）因子（resistencefactor）最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性决定因子（r-determinant），RTF控制质粒copy数及复制，抗性决定因子带有抗生素或重金属的抗性基因。R-因子在细胞内的copy数可从1~2个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。6.降解性（代谢）质粒如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。7.隐秘质粒不显示任何表型效应，只能通过物理的方法检测的质粒。如酵母菌的2um质粒。40年代B.McClintock对玉米的遗传研究而发现染色体易位，打破了基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段的说法。有些DNA片段不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。这似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前已把在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序称为转座因子（transposibleelement），也称作跳跃基因（jumpinggene）或可移动基因（movablegene）。转座因子插入（IS）序列转座子(Tn)特殊病毒（Mu噬菌体）定义：可在DNA链上改变自身位置的一段DNA序列。原核生物中的转座子类型转座的遗传效应插入序列（IS，insertionsequence)分子量最小（仅0.7~1.4kb），只有引起转座的转座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重复序列。已在染色体、F因子等质粒上发现IS序列。E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS，通过这些同源序列间的重组，就可使F因子插入到E.coli的核染色体组上，形成Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS被切离时引起的突变可以回复，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，