11.20分生实验报告质粒DNA的提取纯化与鉴定

实验四质粒DNA的提取，纯化与鉴定DNA体外重组技术【实验原理】是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组分子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。【实验步骤】1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体---分2.构建、改造作为载体的DNA------------切3.目的基因与载体DNA在体外重组--------接4.重组DNA引入受体细胞----------------转5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-------筛【注意事项】目的基因的获得：1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.由mRNA逆转录合成cDNA4.从基因组文库中筛选目的基因5.PCR获得载体的选择：1.能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增；2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3.有一定的筛选标记，易于识别和筛选；4.载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；6.生物安全性好。质粒DNA的提取【实验原理】质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列，通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表达载体（如pET-X、pBI121等）。克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子，因而不能转录，主要用于目的片段的大量制备。表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体（如大肠杆菌）和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控，可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同，可分为两类：一类是“松驰型”质粒，如pMB1/colE1复制子，其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控，不需要任何质粒编码的蛋白质，完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下，其复制仍不停止，；二是“严紧型”质粒，如pSC101，其复制伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白质合成受阻，其拷贝数就不能增加，即在宿主的“严紧”控制下复制。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用的是“松驰型”质粒；但在某些特殊原因（如表达产物对细胞有毒性）下要求用严紧型质粒。构型：超螺旋型SC---结构致密跑得快电泳时最快。开环型OC---体积最大,不易从胶孔中穿过。线型LC---居中。碱裂解法抽提质粒DNA的原理：基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。即利用SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA，在PH=12.6时，染色体DNA完全变性，质粒DNA变性不完全；在PH=4.8时，质粒DNA复性，染色体DNA不能复性。约67%体积分数的无水乙醇中，质粒DNA沉淀。70%的乙醇起洗涤作用。【注意事项】1、质粒DNA提取过程中动作要轻柔，以免对DNA造成损伤2、加SolutionⅠ后一定充分打散悬浮菌体3、加入SolutionⅡ后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性4、加入SolutionⅢ后液体应由浑浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始5、提取质粒后应尽量扣干，因为残留的乙醇可能影响后续实验6、注意温和震荡和剧烈震荡的区别电泳技术【实验原理】带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。带有电荷的生物分子在电场作用下可发生移动。由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。常用的是琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。优点：1.双重效应：电泳效应、分子筛效应。2.操作简单，电泳速度快，样品无需预处理。3.电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。4.凝胶透明且无紫外吸收，可在紫外灯下观看结果。5.易染色，易洗脱，便于定量。核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。【实验结果】上图即为实验数据1；pGEX-2TX-SP1电泳结果可见两条带，即不太明显的RNA带和比较亮且明显的超螺旋DNA带；2；PUC18电泳结果可见四条带，从左至右依次为RNA带，超螺旋DNA带；线状DNA带以及开环DNA带。【结果分析】1、造成出现RNA电泳带的原因：添加溶液时可能未充分混匀，导致RNA未与溶液中的RNA水解酶充分接触，从而导致有未水解的RNA参与电泳。2、不同的DNA分子因所带电荷、分子量的大小和构型不同，在同一电泳系统中的泳动速度不同，可以彼此分离，出现不同的带。3、出现线状DNA带以及开环DNA带的原因：在提取过程中振荡过于剧烈导致DNA开环。整体回顾与分析亮点部分1、因为之前有过移液枪的操作经理，所以本次移液枪操作符合规范2、solutionⅡ现配现用，并且室温放置严格不超过5分钟，加入solutionⅡ、Ⅲ后，混匀溶液3、注意了移液管量程的选择。4、加入氯仿后的移上清液，未混入Pr变形层5、使用离心机的造作符合规范，并且严格控制时间。6、每次出现换药品时都严格更换枪头，防止污染试剂。7、加入70%的乙醇洗涤、离心后，充分干燥后才加入TE不足部分1、第一次加入solutionI时选错移液枪量程，导致小组实验重新开始。2、部分移液步骤出现试剂沾在管壁上的情况3、剧烈震荡时可能时间过短，程度不够深。在中间步骤中时有几步出现无法混匀的情况4、加入氯仿后，离心8分钟，仍有絮状物；再离心2分钟，依然有絮状物。并未进行进一步处理便进行了上清液的提取。5、在加入等体积氯仿和2倍体积无水乙醇时，因为无法测量体积，只能采取估算的方式，可能是本次试验的主要误差来源。6、因为没有对此类实验废料的处理经验，导致部分实验废料被直接扔入垃圾箱。